绿豆过敏原多克隆抗体制备及间接竞争酶联免疫检测方法的建立-论文.pdf

《绿豆过敏原多克隆抗体制备及间接竞争酶联免疫检测方法的建立-论文.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第l3卷第7期中国食品学报V01．13No．72O13年7月JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnologyJu1．2013绿豆过敏原多克隆抗体制备及间接竞争酶联免疫检测方法的建立谈超高爱华张燕王宵雪徐小婧王硕(天津科技大学食品X-程与生物技术学院教育部食品营养与安全重点实验室天津300457)摘要目的：建立绿豆过敏原间接竞争ELISA检测方法。方法：用碱溶酸沉的方法从绿豆中提取总蛋白，考马斯亮蓝G一250法定量蛋白．SDS—PAGE分析4-蛋白的分子质

2、量。采用总蛋白免疫新西兰大耳白兔，初次免疫采用弗氏完全佐剂乳化．免疫剂量为1mg／只；分别在初免后第14、28、32和46天加强免疫，共4次，以弗氏不完全佐剂乳化．免疫剂量为O．5mg／只采用ProteinA—Sepharose4B亲和层析纯化抗血清。通过优化绿豆蛋白的包被量和抗体的稀释倍数，建立间接竞争酶联免疫检测方法。结果：经SDS—PAGE分析得到主要的绿豆蛋白分子质量为50、38、34和25ku。免疫制备的抗绿豆过敏原多克隆抗体效价达到32000。包被绿豆蛋白0．1p,g／~L，抗体稀释1：3200

3、0，建立了间接竞争酶联免疫检测方法，灵敏度IC50=(0．72±0．035)I~g／mL，检出限IC。=(0．72±0．035)g／mL。结论：成功建立了绿豆过敏原间接竞争酶联免疫检测方法。关键词绿豆过敏原：多克隆抗体：间接竞争酶联免疫检测方法文章编号1009—7848(2013)07—0170—05近年来食物过敏患者日益增多，调查表明全1材料与方法世界范围内，食物过敏者大约为15％l1l。在日本，经1．1主要试剂及仪器常发生居民因食用鸡蛋、牛奶、小麦、荞麦、小虾和弗氏佐剂、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G一25

4、0豌豆等食物引起过敏反应的事例嘲。在美国，2％的(Sigma，美国)，紫外一可见光分光光度计(Varian，成人、5％的儿童患有食品过敏症，美国每年发生美国)，蛋白电泳仪(BIO—RAD，美国)，真空冷冻干大约30000例食物过敏反应，而且这一数字还在燥器(Christ，德国)，酶标仪(Thermo，美国)。增长中l3I。近几年，我国人群食物过敏现象13趋增1．2常用缓冲液多，对其的关注也越来越多，但目前我国对于过敏0．01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．4)，0．05mol／L原的监管还未到位。碳酸钠一碳

5、酸氢钠缓冲液(pH9．6)，洗涤缓冲液过敏原检测是有效监管也是避免食物过敏造(含0．05％Tween一20的磷酸盐缓冲液)，封闭液成健康危害的主要手段。虽然绿豆不是主要过敏(0．5％脱；I~-1L粉)，底物体系溶液(TMB一过氧化氢原，但是绿豆是一种常见的食品加工原料，绿豆蛋脲溶液)，1．25mol／L的H2SO溶液。白质高达19．5％～33．1％，也曾有绿豆过敏的报道[41。1．3实验动物至今没有建立绿豆过敏原的特异性检测方法。本雄性新西兰大耳白兔，月龄3个月，体重1．5文通过制备绿豆过敏原、动物免疫，制

6、备绿豆过敏奴，洁净等级：SPF级。饲养于标准化实验动物房，原多克隆抗体，建立间接竞争酶联免疫检测方法，用不含有绿豆组分饲料常规喂养。为食品中绿豆过敏原的快速筛选提供有效方法。1．4绿豆蛋白的制备绿豆(购白天津乐购超市)用高速粉碎机粉碎后，称取50．0g，加入100mL丙酮，于4℃下低速收稿日期：2012—07-07搅拌4—5h除脂，抽滤至绿豆粉中无丙酮为止。将基金项目：国家科技支撑“十二五”食品致敏原分子检测绿豆粉转移至离心管中加入50mL双蒸水．用l技术研究(2011BAK10B03)mol／LNaOH调

7、节pH至9．0，在振荡器上混匀后。4作者简介：谈超，女，1986年出生，硕士第13卷第7期绿豆过敏原多克隆抗体制备及间接竞争酶联免疫检测方法的建立171000r／min离心15min取上清液。上清用lmol／L样品的处理：取5L绿豆蛋白溶液(1mg／mL)至HCI调节pH至4．O，出现大量沉淀，在振荡器上混eppendorf管中，加入5L上样缓冲液，在100oC匀后，4000drain离心15min后取沉淀。上清液重沸水浴中煮沸10min。取出冷却后上样。上样量为复提取2次后，将离心得到的沉淀合并．在真空冷

8、每孔10L。蛋白Marker上样量为5L每孑L。80冻干燥仪中冻干成粉末，在一2O℃中保存备用。V恒压，电泳1．5～2．0h。然后将凝胶放入考马斯亮1．5绿豆蛋白定量蓝R一250染色液中，置于摇床上室温下染色过蛋白溶液定量采用考马斯亮蓝G一250法[71。夜。次日用脱色液脱色，至蛋白条带清晰。1．6绿豆蛋白SDS—PAGE分析1．7多克隆抗体的制备提取后的绿豆蛋白通过SDS—PAGE法进行免疫动物选择新西兰大耳白