孔雀石绿单克隆抗体制备和酶联免疫检测方法的建立.pdf

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1、第44卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第9期2016年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl385—1393DOI：10．11895／j．issn．02530820．160360孔雀石绿单克隆抗体制备和酶联免疫检测方法的建立王宇杨金易徐振林戚平沈玉栋(广州市食品检验所，广州510410)(华南农业大学食品学院，广州510640)摘要针对孔雀石绿三苯环特征结构，设计合成1种高质量半抗原。通过偶联载体蛋白、动物免疫和细胞融合，制备出一株高质量的单克隆抗体MG．DA4一C7，亚类为IgG1，轻链为K型。通

2、过对包被原浓度、抗体浓度、二抗浓度的优化，建立了孔雀石绿间接竞争酶联免疫分析方法。方法半抑制浓度(IC)为0．96L，线性检测范围(IC20～C80)为0．1～8．1L，LOD(ICl0)为0．05L，回归方程Y=_0．32741gx+0．4698(R=0．9891)。本方法特异性高，与代谢物隐孔雀石绿交叉反应小于0．1％，与结晶紫、灿烂绿交叉反应率分别为18．1％和26．5％；实际样品添加回收率为87．3％～107．3％。本方法测定结果经HPLC—MS／MS方法确证，二者相关系数达0．999。本方法可用于鱼类等水产品中孔雀石绿残留的实际检测。关键

3、词孔雀石绿；半抗原；单克隆抗体；抗原识别；酶联免疫分析1引言孑L雀石绿(Malachitegreen，MG，图1)是三苯甲烷类工业染料，从1933年起作为杀菌剂、防腐剂被广泛用于预防与治疗水产动物养殖中的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等¨J。但是，孔雀石绿及其代谢物隐性孔雀石绿具有潜在“三致”作用，可能对人类健康与环境造成危害J。因此，美国、加拿大、欧盟等国家都禁止在水产养殖中使用孔雀石绿，我国于2002年将孑L雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单中》7．。然而，由于孔雀石绿杀菌、防腐效果好，且价格低廉，致使一些生产者受利益驱动在水产品养殖、运输

4、及贮存中违规使用情况依然存在'm』。因此，研究孔雀石绿快速检测方法显得尤为重要¨。目前，检测孔雀石绿的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)¨J、拉曼光谱法、液／质联用分析法(LC—MS)¨和免疫学方法等j。仪器分析方法多数需要昂贵的检测仪器，检测成本高，对操作人员技术要求高，难以满足基层量大面广的现场快速筛查需求；有些仪器方法为增强信号需要将LMG氧化为MG再测定MG含量¨。免疫分析方法具有灵敏度好、特异性高、操作简便、检测成本低、适合现场筛选等特点，已成为食品、药品等领域快速检测技术的重要组成部分。近年来，关于孔雀石绿抗体制备和免疫检测方法建立的

5、研究报道主要是通过羧基化_17I．2l_、氨基化衍生合成半抗原，并制备孑L雀石绿抗体，但该方法重复性较差，本课题组多次重复均无法制备出孔雀石绿的抗体。另外，Yang等¨制备出孔雀石绿多克隆抗体，虽然检测限达0．05g／L，但鉴于多克隆抗体存在制备周期长、批间重复性差等不足，不利于批量生产和应用；Oplatowska等¨通过制备孔雀石绿单克隆抗体建立了免疫检测方法，但检测灵敏度不理想(检测限为0．27L)。因此，本研究在前期研究基础上，采用羧乙氧基手臂半抗原新策略，开展了孔雀石绿单克隆抗体稳定制备及高灵敏度间接竞争酶联免疫检测方法(icELISA)研

6、究，方法检测限可达0．05g／L，经HPLC—MS／MS方法比对验证，本方法检测准确、稳定，整体性能优于现有文献报道，可以满足孔雀石绿的实际检测需求。2实验部分2．1仪器与试剂U一3010A紫外一可见分光光度计(日本Hitachi公司)；Multiskan-MK3多功能酶标仪和Wellwash-MK2洗板机(美国Thermo公司)；API3000液相色谱三重四极杆质谱仪(美国Perkin—Elmer公司)；2O163—11收稿；2016-06-06接受本文系国家自然科学基金(No．31371769)，广东省科技计划项目(Nos．2014A02021

7、9008，201317040402006，2O16A04o403o77)，广东省自然科学基金项目(Nos．2013030013338，2014A030306026)项目资助。E—marl：syd—tyx@163．com1386分析化学第44卷N1／＼NlN．／、／NlMalachitegreen(MG)Malachitegreencarbinolform(MGC)图1孔雀石绿及其结构类似物结构式Fig．1ThechemicalstructuresofMGanditsstructuralanaloguesDRX-400／600核磁共振仪(德国Burk

8、er公司)。N，N-Z．甲基苯胺(AR，中国亭新化工试剂厂)；羧基苯甲醛、羟基苯甲醛、氯乙酸钠、孔雀石绿、孔雀绿(98％，