神经干细胞体外培养技术

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1、神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neuralstemcells,NSCS)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。此外，NSC还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学

2、研究和临床实践中首先面临的关键问题。本实验拟建立绿色荧光蛋白（Greenfluorescentprotein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICADMIRB）冰冻切片机（LeicaCM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP8001单臂

3、脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISIONSAMPLINGCORP，BATONROUGE，LOUISIANA，MadeinUSA）0.5ml、1mlEppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。1（二）试剂1.DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。2.碳酸氢钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾，氯化钾，氯化钠，多聚甲醛等为国产分析纯试剂，谷氨酰胺，青霉素，链霉素。（三）

4、主要试剂的配制1.基础培养基DMEM/F121:1的配制DMEM粉剂1.34g，F121.06g。（1）称取以上试剂量后放入200ml烧杯中。（2）加三蒸水至200ml搅拌溶解。（3）用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调pH值为7.20。（4）过滤分装，置4℃冰箱保存。2.D-Hanks液（g/L）的配制KCl0.40g，KH2PO40.06g，NaCl8.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4·7H2O0.09g，酚红0.01g。（1）称取以上试剂量。（2）取1000ml烧杯盛约700ml三蒸水，依次加入所称试剂量溶解。（3）再加足水至1000ml。（4

5、）用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调pH值为7.20。（5）过滤分装，置4℃冰箱保存。3.抗生素液配制6青霉素1×10IU/甁，链霉素1g/瓶。4加入0.9%无菌的生理盐水50ml，即可配制成青霉素浓度为2×10IU/ml，链霉素浓度为20mg/ml液体，无菌分装，-20℃保存，使用时稀释成青霉素工作浓度为100IU/ml、链霉素为100μg/ml。4.bFGF-20℃保存，使用时用三蒸水稀释至20ng/ml的工作浓度。5.3.6%水合氯醛溶液的配制：称取3.6g水合氯醛置于250ml量筒中，加入少量无菌生理盐水溶解后定容至100ml。6.培养液的准备2DMEM

6、/F121:1100mlGB液9ml混合后，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，双抗（青、链霉素）各0.25ml每瓶分装为10-20ml，4℃储存。bFGF2μgB271ml7.4%多聚甲醛磷酸缓冲液的配制：称取40g多聚甲醛置于1000ml烧杯中，加入0.1mol/LPBS800ml，60℃加热至多聚甲醛完全溶解为止，冷却后滴加1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液，用PHS-3C型精密pH计调整pH值在7.2-7.4之间，添加0.1mol/LPBS定容至1000ml，4℃冰箱内保存备用。8.铬明胶溶液的配制：分别称取5g明胶和0.5g铬明矾，用60℃800ml左右的单

7、蒸水先溶解明胶后，再加入铬明矾，待完全溶解后定容至1000ml，过滤，用于包被玻片。包被时将玻片浸入60℃的铬明胶溶液中15-20min，取出后37℃烤干备用。9.20%、25%、30%蔗糖溶液的配制：分别取蔗糖20g，25g，30g，分别用0.1mol/LPB缓冲液溶解后，定容至100ml。三实验步骤（一）神经干细胞悬液制备取孕E12～14d的GFP转基因小鼠，用75％乙醇浸泡消毒GFP转基因孕鼠。无菌条件下，剪开腹部皮肤及皮下筋膜，暴露并分离子宫，取出子宫，将其放入含D-Hanks液的培养皿中清洗。用剪刀，镊子分离胎鼠（1