探索神经干细胞体外三维培养及其模型研究

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1、大连理工大学硕士学位论文神经干细胞体外三维培养及其模型研究姓名：王奇申请学位级别：硕士专业：化学工程指导教师：刘天庆20090701大连理工大学硕士学位论文摘要神经干细胞(Neuralstemcells，NSCs)作为一种具备自我更新能力及多向分化潜能的细胞，自被发现以来，就因其对神经系统的修复能力而受到广大学者的关注。但是神经干细胞的来源受限及数量不足是临床应用的最大障碍。采用体外培养以实现大规模扩增是这个问题的一种有效解决办法。然而，在二维神经球悬浮培养条件下，由于球体自身结构的制约，随着神经球的直径增长，营养物质由外及内传递以及细胞代谢物由内及外扩散均受到影响。考虑到生物支架材料—胶

2、原(CollagenI，COLI)在干细胞体外大规模培养领域的应用，如果把细胞接种在由胶原制成的三维支架材料中进行培养，将会成为一个更有效的神经干细胞培养方式。为了深入了解神经干细胞在由胶原制成的三维支架材料中的生长状况，本文将实验数据与传质代谢方程相结合，通过求解数学模型，计算支架内各种代谢物质的浓度分布，进而筛选出最有利于培养神经干细胞的胶原支架厚度和适宜的细胞接种密度。首先，从E14小鼠胚胎海马脑组织中获得原代细胞，体外无血清悬浮培养，利用诱导分化和免疫荧光对传代细胞进行生物学鉴定，同时测定单个神经干细胞对溶解氧的代谢参数。其次，检测细胞一胶原支架的葡萄糖、乳酸代谢情况，与传质代谢模

3、型计算结果进行比对，验证模型的可靠性。最后，通过计算不同厚度胶原支架内代谢物质的浓度分布，选择最佳成胶工艺参数。实验结果表明：①所培养的细胞具有增殖能力和分化潜能，符合神经干细胞的定义，可用于单个神经干细胞氧代谢的研究。②对所培养的神经干细胞氧代谢的测定结果显示，单个神经干细胞的氧代谢速率为2．9X10～4mmol／cell／s。⑨胶原的终浓度不宜低于lmg／ml，否则无法满足三维支架制备过程中对机械强度的要求。④在葡萄糖初始浓度5．08×10～mmol／ml、培养基液层厚度5mm、细胞接种密度1x106cells／ml为培养条件下，2mm厚度的胶原支架完全能够满足细胞正常生长对葡萄糖、乳

4、酸和溶解氧浓度的要求。结合模型计算，最终确定神经干细胞接种于胶原支架内进行体外三维培养的适宜条件为：凝胶层厚度2rnrn、培养基液层厚度5rnm、细胞接种密度2×105cells／ml。关键词：神经干细胞；胶原支架；代谢；传质；模型计算神经干细胞体外三维培养及其模型研究Studyof3一DcultureinvitroandmodelingofNSCsAbstractMoreandmoreattentionhasbeenpaidonneuralstemcellsfNSCs)sincetheirmagicpotentialinneurologicrepairwasfound．Asubstant

5、ialamountofNSCswillberequiredforeelltransplantation．AndhighexpansionratesofNSCsinculturearethuscrucialfortheclinicapplication．However，thisdemandhasnotbeensatisfiedbecauseoftheNSCs’specialgrowthmode--neurosphereinsidewhichanecroticcoremayappearwhenthesizeofitreachesacertaincriticalvalue．Considering

6、theapplicationofcollagen(COL)invitroculture．ifWeinoculatecellsintoacell．COLsystemandculturethemina3一Dscaffoldenvironment。theresultmaybecomemoreeffective．Combinedexperimentaldatawithmathematicalmodel．metaboliteconcentrationdistributionofNSCsinCOLCOuldbeobtained，themostsuitablethicknessandinoculumde

7、nsityCanalsobedetermined．Intheexperiment，NSCswereseparatedfromthehippocampusofEl4mice，andculturedinserum．freemedium．ThedifferentiationpotentialandtheabilityofproliferationofNSCswereidentifiedbyfluorescentdyeandim