体外血管生成三维培养模型的构建

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1、体外血管生成三维培养模型的构建作者：林菊丽王彪黄祖根吴正思鲁开化庄福连【摘要】目的建立脐静脉内皮细胞（HUVECs）的体外血管生成的三维培养模型。方法以酶消化法获得以HUVECs为主的混合细胞悬液，经反复贴壁法分离纯化HUVECs，通过免疫细胞化学染色鉴定。采用夹心培养法构建HUVECs的体外血管生成三维培养模型。结果HUVECs在胶原凝胶之间，24h左右血管样结构的分支之间相互沟通连接形成复杂的网状结构，2d后凝胶内的细胞开始退化，3d发现大部分细胞出现崩解。24h凝胶经HE染色可见细胞索及原始血管腔

2、形成。结论成功建立体外血管生成的三维培养模型。夹心培养法是较为成熟的体外血管生成的三维培养方法，具有操作简便、三维血管样结构形成数量多、网络结构复杂等特点。【关键词】内皮，血管；内皮细胞；细胞，培养的；细胞培养技术；脐静脉；新生血管化，病理性血管生成即由原有血管出芽生长形成新生血管的过程，血管生成参与多种生理和病理过程，如发育、再生、炎症和肿瘤的生长与转移等[12]。肿瘤血管生成已成为当前肿瘤研究的热点，通过抑制肿瘤血管生成进行抗肿瘤治疗，被认为是非细胞毒性治疗肿瘤中最具前途的方法之一[34]。内皮细

3、胞的三维培养法是利用血管内皮细胞在三维条件下形成血管状结构的特点，模拟体内的血管形成过程，是揭示体内血管形成的最佳体外模型。本研究利用分离纯化的脐静脉内皮细胞（HUVECs）、选用夹心培养法构建体外血管生成的三维培养模型，目的在于获得体外三维血管样结构，以便进一步在体外研究血管生成的抑制实验。这对评估各种影响因素对血管生成的影响具有实际应用价值[5]，并为今后针对肿瘤性血管生成的肿瘤治疗方法提供实验依据。1材料与方法1.1材料1.1.1主要器材及试剂超净工作台（BCM1000，苏州苏净集团）；体积分数为

4、0.05的CO2恒温培养箱（美国REVCO公司）；倒置显微镜(OlympusCK40，日本)、台式冷冻高速离心机（HERMLEABORTECHNIKZ323K，德国）；数显鼓风干燥箱（MBEGZX907，上海博迅公司）；胎牛血清及M199培养液(美国Hyclone产品)、鼠尾胶、Ⅰ型或Ⅱ型胶原酶、胰酶(1∶250)消化液（美国Sigma公司）、血管内皮生长因子（VEGF；美国Peptrotech公司），鼠抗人单克隆CD31抗体、CD34抗体、第Ⅷ因子抗体（美国SantaCruz公司），UltraSens

5、itiveTMSP超敏试剂盒（福州迈新公司）。1.1.2对象取福建医科大学附属第一医院住院育龄健康产妇剖腹产后的新鲜胎儿脐带组织，长约20cm，置于含100μ/mL青霉素、100μg/mL链霉素的4℃PBS缓冲液中分离纯化。1.2方法1.2.1HUVECs的分离纯化并鉴定1.2.1.1酶消化法获取HUVECs混悬液参照3讨论血管内皮细胞的分离和培养在认识正常的血管新生和肿瘤血管生成及血管病理生理等过程中发挥了关键作用。内皮细胞的体外三维培养模型是模拟及揭示体内血管形成过程的最佳体外模型。血管内皮细胞是位于

6、循环血液与血管壁内皮下组织之间的单层细胞，具有多种重要的生理功能。本实验采用的是人HUVECs，它是体外研究血管内皮细胞的重要来源，除具有来源充足、获取方便、能获得较多细胞等优点外，与来源于动物的内皮细胞相比，实验条件和结果更符合人体情况。1980年，Folkman等首次观察到内皮细胞在体外培养体系中具有形成血管样结构的趋势，由此揭开了内皮细胞体外三维培养的序幕[8]。Martins等证实在三维培养体系与二维培养体系中内皮细胞的生物学行为存在着显著差异，三维培养体系中内皮细胞的生长更类似于体内血管生成[9

7、]。近20余年来，内皮细胞的体外三维培养技术日臻成熟。体外三维培养技术主要包括表面培养法、夹心培养法、混合培养法、微载体培养法以及基质内细胞聚集体侵袭法等，这些方法目的相同、价值相似，但选用何种方法在不同的基质及条件中有不同的选择。本实验所采用的是被广大学者所采用的夹心培养法,它操作简单方便，较适合常规倒置显微镜连续观察内皮细胞形态改变及迁移、血管样结构形成的过程，并可借助计算机辅助技术进行血管样结构的数目及长度的计数。它为离体细胞的生长更好的提供三维空间,是在体血管生成最简单的模型。本研究所采用的细胞外

8、基质Ⅰ型胶原是一种比较常用的细胞外基质，它可以增强细胞的贴附性，凝固后形成具有一定的展性的凝胶，用“三明治法”在其夹心中接种细胞，可见细胞的移行和向胶原内浸润，并形成管腔样结构。这与Ingber等所阐述的理论相符，即内皮细胞包埋在有展性的胶原中可以分化，形成静态管型；而在硬度较大的胶原中只增殖，形成单层细胞[10]。本实验显示，细胞接种12h后相邻的细胞伸展、延长进而相连形成血管样结构，24h可见到血管样结构互相连接形成网络样