体外血管生成三维培养模型的构建

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1、体外血管生成三维培养模型的构建作者：林菊丽王彪黄祖根吴正思鲁开化庄福连【摘要】目的建立脐静脉内皮细胞（HUVECs）的体外血管生成的三维培养模型。方法以酶消化法获得以HUVECs为主的混合细胞悬液，经反复贴壁法分离纯化HUVECs，通过免疫细胞化学染色鉴定。采用夹心培养法构建HUVECs的体外血管生成三维培养模型。结果HUVECs在胶原凝胶之间，24h左右血管样结构的分支之间相互沟通连接形成复杂的网状结构，2d后凝胶内的细胞开始退化，3d发现大部分细胞出现崩解。24h凝胶经HE染色可见细胞索及原始血管腔形成。结论

2、成功建立体外血管生成的三维培养模型。夹心培养法是较为成熟的体外血管生成的三维培养方法，具有操作简便、三维血管样结构形成数量多、网络结构复杂等特点。【关键词】内皮，血管；内皮细胞；细胞，培养的；细胞培养技术；脐静脉；新生血管化，病理性血管生成即由原有血管出芽生长形成新生血管的过程，血管生成参与多种生理和病理过程，如发育、再生、炎症和肿瘤的生长与转移等[12]。肿瘤血管生成已成为当前肿瘤研究的热点，通过抑制肿瘤血管生成进行抗肿瘤治疗，被认为是非细胞毒性治疗肿瘤中最具前途的方法之一[34]。10内皮细胞的三维培养法是

3、利用血管内皮细胞在三维条件下形成血管状结构的特点，模拟体内的血管形成过程，是揭示体内血管形成的最佳体外模型。本研究利用分离纯化的脐静脉内皮细胞（HUVECs）、选用夹心培养法构建体外血管生成的三维培养模型，目的在于获得体外三维血管样结构，以便进一步在体外研究血管生成的抑制实验。这对评估各种影响因素对血管生成的影响具有实际应用价值[5]，并为今后针对肿瘤性血管生成的肿瘤治疗方法提供实验依据。1材料与方法1.1材料1.1.1主要器材及试剂超净工作台（BCM1000，苏州苏净集团）；体积分数为0.05的CO2恒温培养箱

4、（美国REVCO公司）；倒置显微镜(OlympusCK40，日本)、台式冷冻高速离心机（HERMLEABORTECHNIKZ323K，德国）；数显鼓风干燥箱（MBEGZX907，上海博迅公司）；胎牛血清及M199培养液(美国Hyclone产品)、鼠尾胶、Ⅰ型或Ⅱ型胶原酶、胰酶(1∶250)消化液（美国Sigma公司）、血管内皮生长因子（VEGF；美国Peptrotech公司），鼠抗人单克隆CD31抗体、CD34抗体、第Ⅷ因子抗体（美国SantaCruz公司），UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒（福州迈

5、新公司）。101.1.2对象取福建医科大学附属第一医院住院育龄健康产妇剖腹产后的新鲜胎儿脐带组织，长约20cm，置于含100μ/mL青霉素、100μg/mL链霉素的4℃PBS缓冲液中分离纯化。1.2方法1.2.1HUVECs的分离纯化并鉴定1.2.1.1酶消化法获取HUVECs混悬液参照文献[6]方法。在无菌条件下，将新鲜的胎儿脐带脐静脉一端置入已磨平的16号针头，止血钳固定，注入PBS缓冲液反复冲洗至无血迹。止血钳夹住静脉另一端，以20mL的注射器向脐静脉内徐徐注入0.1%胶原酶溶液，至血管充盈。立即将脐带放入3

6、7℃培养箱内，15～25min后取出。松开止血钳，通过注射器向脐静脉内灌注PBS液，收集流出液置离心管内，1000r/min离心10min。弃上清，以M199完全培养液重新悬浮细胞，并接种于预先以明胶覆盖的100mL的玻璃培养瓶内。1.2.1.2反复贴壁法纯化HUVECs将接种HUVECs混悬液的培养瓶于培养箱内静置2010min。倒置显微镜下观察见部分细胞贴壁，稍加摇荡不浮起，将培养液连同尚未贴壁的细胞一起倒入或吸到另一培养瓶中。重复上述操作2～3次后，将HUVECs和成纤维细胞分离开，所得的细胞混悬液为HUVE

7、Cs与血液系统细胞的混合液。将混合液静置培养，24h后换液，使用PBS漂洗贴壁生长的HUVECs，洗脱悬浮生长的血液系统细胞，得到纯化的HUVECs，可见到贴壁生长的HUVECs，以后隔天换液，待长满后1∶2～3传代培养。A:4h左右开始贴壁,形成单层多细胞集落，细胞呈梭形（×100）；B:接种培养5d后细胞融合生长，并铺满培养瓶底，呈铺路石状（×100）；C:HUVECs呈圆形，胞核及核仁清晰可见（×400）　　1.2.1.3HUVECs的鉴定应用免疫细胞化学染色法检测CD31、CD34、第Ⅷ因子的表达，使用SP

8、染色法，操作按试剂盒说明书进行。用已知标准片作为阳性对照，同时用PBS替代第一抗体做阴性对照。1.2.2体外血管生成的三维培养模型的构建参照文献[7]方法加于改良。取7份鼠尾胶溶液、1份10×M199培养液、1份胎牛血清和1份0.2mol/LHEPES溶液及终浓度40ng/mL的VEGF，在冰浴下迅速混合成胶原工作液。于12孔细胞培养板每孔加入500μL，置