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《黄芪甲苷对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、黄英甲昔对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用影响摘要：目的观察黄茂甲昔对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的影响，并探讨其作用机理。方法体外分离培养大鼠胚胎神经干细胞，Nestin免疫细胞化学染色进行神经干细胞的鉴定，BrdU标记鉴定增殖。采用稀释法检测黄英甲昔高、中、低剂量组(6、0.6、0.06?mol/L)对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的影响。结果Nestin染色为阳性,BrdU的增殖鉴定为阳性。与对照组相比，黄英甲昔高、中、低剂量组神经球生成数目明显增加。结论黄茂甲昔能够明显增加神经球生成数目，具有促进胚胎神经干细胞体外增殖的作用。关键词：神经干细胞；黄英甲昔；增殖D0I
2、：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.05.015中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1005-5304(2013)05-0042-03学基础［1］。近来，很多研究表明，NSCs和神经前体细胞的替代移植疗法对治疗脑和脊髓损伤、帕金森病及周围神经损伤等神经组织疾病具有强大的应用价值［2-5］o中医药疗法在神经元保护和修复方面显示了一定作用。现代研究发现，黄英不同提取物具有抗氧化、抗炎、扩张血管、改善脑血流等作用［6］。黄茯甲昔是从黄茂总昔中分离得到的一类单体化合物，是黄茂的主要活性成分之一。本实验采用黄竄甲昔对大鼠胚胎干细胞增殖作用进行研究
3、，为中枢神经系统疾病和损伤的修复提供实验基础和临床应用依据。1实验材料1.1培养基、试剂与药物HBSS液(无钙离子和镁离子，LONZA,USA)；DMEM/F12(1：1)培养液(HycloneLaboratories,USA)；B27添加物(GIBCO,USA)；重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,ProSpec-Tany,Isreal)；人表皮生长因子(EGF,StrathmannBiotec,Germany)；青霉素-链霉素溶液(双抗，100X，Sigma)；Nestin小鼠单克隆抗体(SantaCruz,USA)；BrdU小鼠单克隆抗体(Sigma,German
4、y)；ABC试剂盒(VectorLaboratories,USA)；DAB试剂盒(VectorLaboratories,USA)；黄英甲昔、丹酚酸B(天津中一制药)。1.2仪器MC0-5M型02/C02孵箱(Sanyo,Japan)；CK30倒置显微镜、1X70荧光倒置显微镜(Olympus,Japan)o2实验方法2.1神经干细胞原代培养及传代孕16dSD大鼠，脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒，无菌条件下打开腹腔，取出串珠状子宫，浸泡于冷HBSS液中，取出胚胎，置于另一冷HBSS液中，小心剥离外层骨膜，取出大脑皮质并去除软脑膜，冷HBSS液漂洗2次，转移至离心管加入一定量冷H
5、BSS,吹打呈均匀悬浊状，过200目(70?m)筛网，1000r/min离心8min,弃上清，以全培基(含2%B27,20?g/LbFGF,20?g/LEGF的DMEM/F12,1%双抗的HBSS液)重悬，约3〜4个胎鼠/75cm2的密度种入培养瓶中，37°C.5%CO2培养箱中培养。每2〜3d行半量换液1次。约5〜9d传代1次。传代后以1X105个/mL的密度全培基重悬种入培养瓶或培养板。2.2神经干细胞亚代克隆Nestin鉴定将经过多次连续传代所形成的亚代克隆细胞球接种于预先置有50?g/mL多聚赖氨酸涂层盖玻片的6孔板中，贴壁生长2ho经4%多聚甲醛固定后，0.3%T
6、ritonX-100室温通透，正常血清封闭，滴加Nestin小鼠单克隆抗体，行ABC法免疫组织化学染色。染色后，以50%甘油封片，在普通光学显微镜下观察照相。2.3神经干细胞BrdU标记及增殖鉴定将NSCs亚代克隆细胞球制成lX105/mL的细胞悬液，培养3d后掺入BrdU(10?mol/L),24h后吹散NSCs克隆球，收集细胞接种于预先置有50?g/mL-多聚赖氨酸涂层盖玻片的6孔板中，贴壁生长2ho经4%多聚甲醛固定后，用盐酸变性硼酸中和，然后以正常血清封闭。滴加单克隆Anti-BrdU抗体（1:800）,41过夜，行ABC法免疫组织化学染色，并以苏木素复染，以50%
7、甘油封片，在普通光学显微镜下观察照相。2.4有限稀释法检测黄英甲昔对神经干细胞的增殖作用将NSCs克隆球制成1X105个/mL的单细胞悬液，将该细胞悬液稀释240倍，分别加入0.035?mol/L丹酚酸B和不同剂量的黄英甲昔（6、0.6、0.06?mol/L）,种入24孔板。共设5组（对照组、丹酚酸B组及黄英甲昔高、中、低剂量组），每组4孔。常规培养4d后对神经球进行计数（包含细胞25）。3统计学方法采用SPSS11.5统计软件进行分析。实验数据以一x土s表示，采用方差分析。P5讨论NSCs源于胚胎干细胞和成年干细
