Maro 145悬浮培养细胞系的建立及培养研究.pdf

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1、密级：公开分类号：Ｓ８ＩＷＵ《尖聲馨系；硕±学位ｉ仑文煙目：Ｍａｒｏ１４５悬巧巧养细胞系的建立及巧养研究■Ｗ姓《：鸟整：Ｙ１４２１４０５２２学号学院：生命科学写工程学院：预防首医学专业研究方向：动物细胞工程（疫苗方向）导师：巧家林教巧二〇－走年五月ＳｔｕｄｉｅｓｏｎＳｕｓｐｅｎｓｉｏ凸ＣｅｌｌｌｉｎｅＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄＣｕ－１４５ｌｔｕｒｅｏｆＭａｒｃＡＴｈｅｓｉｓＳｕｂｍｉｔｔｅｄｆｏｒｔｈｅＤｅｇｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒＣａｎｄｉ

2、ｄａｔｅ：ＭａＨｕａＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ；Ｐｒｏｆ．ＢａｉＪｉａｌｉｎＮｏｒｔｈｗｅｓｔＭｉｎｚｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＬａｎｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ关于学位论文使用授巧的声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的作品，知识产权归属西北民族大学。本人完全了解西北民族大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学校保存或向国家有关部口或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权西北民族大学可Ｗ将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与

3、该论文直接相关的学术论文或成果时一，第著名单位仍然为西北民族大学。保密论文在解密后应遵守此规定。之、；导师签名日期。．良论文作者签名Ｊｔ－＿；１原创性声明：本人郑重声明本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均己在文中明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。■＾＇３衣＾＇＾论文作者签名：日期：

4、１．项目基金来源本研巧由Ｗ下顶目资金资助１国家民委领军人才计划资助２甘肃省农业生物技术专项ＧＮＳＷ－２０１４－２４（）３西北民族大学中央高校基本科研业务费专项资金项目口１９２０１５００２９）ｍ摘要猪繁殖与呼吸综合征（ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＲＲＳ），一是种引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状的病毒性传染病，具有很高的传，几乎遍及世界所有养猪国家，染性和死亡率，给世界养猪业造成严重经济损失接种疫苗仍是最直接有效的预防措施。国内外ＰＲＲＳ疫苗采用转瓶贴壁培养

5、Ｍａｒｃ－１４５増殖病毒的生产工艺。生物反应器悬浮培养细胞生产疫苗是世界范围内生物医药产业转型升级的必由之路立是这一工艺的关键技术，而悬浮细胞系的建一－摇床体系对低环节之。本文采用骤减血清法与适应降血清法，利用桂化摇瓶一ａｒｃ－２２代获得血清Ｍ１４５贴壁细胞连续悬浮驯化传代培养了株悬浮轴胞，并对其在５Ｌ生物反应器中大规模培养特性和病毒增殖能力进行了研究。获得Ｗ下主要研究结果：一１ＣＣＴＣＣ引进Ｍｒｃ－．从株贴壁培养ａ１４５细胞，扩增培养建立了细胞库，冻－存４０支，并对其生物学特性进行了评价。引进的Ｍａｒｃ１４５贴壁细胞的无菌检査、Ｍａｒ

6、ｃ－支原体检查、外源因子检测结果均为阴性。复苏的１４５贴壁细胞生长稳定，生长曲线庭近于细胞的典型生长曲线且基本呈＂＂％Ｓ型，平均活力达到９７，最大４增殖密度为５７．８ｘｌ〇ｃｅｌｌｓ／ｍＬ，倍增时间为３０．２ｈ。２Ｍａｒｃ－．采取骤减血清法与适应降血清法将１４５贴壁细胞的血清含量从１０％一ａｃ－－降至２％，获得株２％低血清Ｍｒ１４５贴壁细胞。该株低血清Ｍａｒｃ１４５贴壁细５胞Ｗ１：３传代，细施生长稳定，形态良好，细胞最大增殖密度达４．０３ｘｌ〇ｃｅｌｌｓ／ｍＬ，细胞活力％．５％，群体倍増时间为５１．９ｈ。－３－．利用插化摇瓶摇床体系低血清

7、Ｍａｒｃ１４５贴壁细胞连续悬浮驯化传代培养一－－－－２２Ｍａｒｃ４５Ｍ１４５ＸＦ。Ｍ－１４５ＸＦ代得到株１悬浮细胞，命名为ａｒｃ对ａｒｃ细胞－扩增、建立细胞库ａｒｃ１４５－ＸＦ。驯化后的Ｍ细胞无菌试验、支原体检查、外源因一－子检测结果均为阴性；染色体检查与贴壁型Ｍａｒｃ１４５细胞致８，。连续传代６一－ｘ。Ｍａｒｃ－１５ＸＦ〇ｌ〇ｃｅｓｍＬ细胞生长正常，形态均传代培养４细胞Ｗ．５ｌｌ／在无血清培养基中添加２％新生牛血清在培养至４８ｈ进行分种传代培养效果最佳，最６大增殖密度为３．２２ｘｌ〇ｃｅｌｌｓ／ｍＬ