地黄毛状根的诱导及细胞悬浮培养体系的建立

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1、分类号：单位代码：１．０４４１密级：学号：２０１２０２１２１＾＇。＊＇．化Ｔｒ－、，Ｓ；二？山系中雇為走爹、ｉｃ：、＾’，严’、＇＾产，－＿■若统招－ＴＴ■颐±化乂＾＾中文题目：地黄毛状根的诱导及细胞悬浮培养体系的建立英文题目：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｉｓｈａｉｒｙｒｏｏｔｓｎｄｅｓｔａｂｌｈｍｅｎｔｏｆｃｅｌｌｓｕｓｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓｓｔｅｍｏｆ；：，ｐｙ＾ＲｅｈｍａｎｎｉａｌｕｔｉｎｏｓａＬｉｂｏｓｃｈｇ＾申请人姓名刘连曰王入学年月２

2、０１２年９月学科专业中药学指导教师张永清教授李先恩研究员学位类型医学科学学位２０１５年５月２０日．．原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立完成的，文中除注明引用的内容外，不包含任何其他己经发表的科研成果。对本文研究做出重要贡献者，均已在文中Ｗ明确方式表明。本声明的法律责任完全由自己承担。、。．论义作者签名八屯４哥师＾名日期４，化＾句关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部口机构送交论文的复印件和电子版，

3、允许被查阅和借阅。本人授权山东中医药大学可将本学位论文的全部或手部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或其他复印段保存和汇编本学位论文。论（保密论文在解密后应遵守此规定）义化者蔡名导师驚名日期喊心提要目的：地黄（RehmanniaglutinosaLibosch）为玄参科地黄属多年生草本植物，药用部位为新鲜或干燥块根，属于我国常用大宗中药材。梓醇是地黄的主要活性成分之一，具有神经保护、降血糖、利尿和缓泻等药理活性。近年来，地黄药材的市场需求量迅速增加，人工种植面积越来越大，寻求一条可持续发展道路来解决地黄药材供应问题迫在

4、眉睫。本研究通过诱导地黄毛状根和建立悬浮细胞培养体系，以期为地黄毛状根及悬浮细胞大规模培养和活性物质工业化生产奠定基础。方法：利用发根农杆菌Accc10060诱导地黄叶片产生毛状根，探讨光照、菌液浓度、共培养时间、侵染时间和乙酰丁香酮对毛状根诱导率的影响，结合PCR技术对毛状根进行鉴定。利用地黄愈伤组织建立悬浮培养体系，对植物激素、碳源、pH值、接种量、装液量和继代时间等6种影响因素进行研究，并采用HPLC方法测定悬浮培养细胞中活性物质梓醇的含量。另外，通过添加外源诱导子，探讨悬浮细胞生物量和梓醇含量的变化。结果：发根农杆菌Accc10060侵染地黄叶片能

5、成功诱导出毛状根，最佳诱导条件：暗培养，菌液OD-1600的值为0.6，侵染时间10min，共培养时间4d，AS浓度为200μmol·L。PCR反应结果显示毛状根为阳性。建立了地黄悬浮细胞培养体系，优化后的悬浮细胞培养条件：以蔗糖为碳源，浓度45g·L-1，pH值6.0，每瓶接种量为细胞鲜重0.6g，每瓶装液量为40mL（100mL三角瓶），激素配比为2.0mg·L-12,4-D和0.5mg·L-16-BA。地黄悬浮培养细胞生长曲线呈S型，接种15d时细胞生物量达到最大值，梓醇含量最高值出现在第24d。添加1.0mg·L-1水杨酸、10mg·L-1酵母提取

6、物和400mg·L-1酸水解酪蛋白均能提高悬浮培养细胞中梓醇的含量。结论：用发根农杆菌Accc10060侵染地黄叶片能够诱导出毛状根，建立了地黄细胞悬浮培养体系，在进行悬浮培养时添加诱导子可以提高梓醇含量，为地黄毛状根和悬浮细胞的大规模培养及梓醇等活性物质的工业化生产奠定了基础。关键词地黄；毛状根；愈伤组织；悬浮培养；梓醇地黄毛状根的诱导及细胞悬浮培养体系的建立InductionofhairyrootsandpreliminaryestablishmentofcellsuspensioncultureofRehmanniaglutinosaLiboschS

7、peciality：ChinesemateriamedicaAuthor：LiuLianwangTutor：ZhangYongqing；LiXianenAbstractObjective:RadixRehmanniaederivingfromthefreshordryrootofRehmanniaglutinosaLibosch,belongtothebigChinesemedicinalmaterialsincommonus.Catalpol,oneofthemainactivecomponentsofRadixRehmanniae,hasthephar

8、macologicalactivitiesofhypoglycem