农杆菌诱导北柴胡毛状根体系建立及ugt基因功能初步研究

《农杆菌诱导北柴胡毛状根体系建立及ugt基因功能初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据学校代码：10225学号：S14536学位论文农杆菌诱导北柴胡毛状根体系建立及OaT基因功能初步研究指导教师姓名：申请学位级别：论文提交日期：授予学位单位：杨洪一硕士2014．4孙晶副教授东北林业大学东北林业大学学科专业：微生物学论文答辩日期：2014．6授予学位日期：答辩委员会主席：论文评阅人：许修宏许修宏王立群聋夕厶栉素犬学万方数据UniversityCode：10225RegisterCode：S14536DissertationfortheDegreeofMasterCultureofHairyRootsofBupleurumchin

2、enseInducedbyAgrobacteriumrhizogenesandBio．．functionAnalysisofUGTCandidate：Supervisor：AssociateSupervisor：AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：Dateof0ralExamination：University：SunJingYangHongyiMasterMicrobiologyJune，2014NortheastForestry万方数据摘要北柴胡(BupleurumchinenseDC．)是中药柴胡的重要基源植

3、物，柴胡皂营是其主要药效成分。糖基转移酶(UDP—glycosyltransferase；UGT)是柴胡皂苷生物合成途径的后修饰酶，其中后修饰作用是形成柴胡皂苷种类多样性的主要因素。本研究对可能参与皂苷生物合成的BcUGTIO基因进行功能验证。一方面，以发根农杆菌为诱导菌株，建立北柴胡毛状根诱导体系，进行发根农杆菌介导的北柴胡BcUGTIO基因的遗传转化初步研究。另一方面，构建BcUGTIO基因原核表达载体，诱导其表达，利用重组酶蛋白进行体外酶活分析，探究BcUGTIO基因的功能，为最终阐明柴胡皂苷生物合成途径奠定基础。具体研究结果如下：l设计多种诱

4、导条件，包括不同菌种种类、外植体类型、侵染方式和侵染时间等，探索建立稳定的北柴胡毛状根诱导体系。结果在采用发根农杆菌A4侵染北柴胡无菌苗叶基部，菌液浸染20min，置于固体培养基(Bs+乙酰丁香酮200I

5、tmol／L+蔗糖20g／L或MS+NAA6mg／L+乙酰丁香酮200¨mol／L+蔗糖20g／L)共培养3d后，转入抑菌培养，10d左右发出毛状根。由此建立了北柴胡毛状根诱导体系。2设置多种处理，包括3种培养基：B5、改良White和WPM，3种外源激素种类：IBA、IAA和NAA，真菌诱导子为黑曲霉诱导子，每组处理设计2～4个浓度梯度，培养三个

6、月收获称重，测定其产量变化，HPLC方法检测毛状根柴胡皂苷含量。结果在添加0．5mg／LIBA的B5培养基中，毛状根产量(干重)和柴胡皂昔产量最高，分别为2．4g和9．05mg。筛选出北柴胡毛状根最适离体培养条件。3以北柴胡毛状根诱导体系为基础，进行发根农杆菌介导的BcUGTIO基因转化北柴胡初步研究。诱导产生的毛状根经25mgm潮霉素筛选获得3条抗性毛状根，PCR检测后，未得到阳性转化毛状根。后续将重新侵染一批外植体，期望获得转基因毛状根。4通过拟南芥浸花法，进行根癌农杆菌介导的BcUGTIO基因转化北柴胡初步研究。经30mgm潮霉素筛选得到抗性拟

7、南芥植株12株，PCR检测后，均为阳性。后续将对阳性植株提取总蛋白，进行酶催化反应并对其进行酶催化活性分析，对比含有UGT基因的拟南芥与普通的拟南芥在酶活反应中差异性。5设计含有酶切位点的引物，PCR扩增BcUGTIO基因ORF，酶切后，插入到PGEX一4T一2载体中，最终构建出原核表达载体。为后续开展体外酶蛋白表达、纯化和催化活性分析实验，验证其生物功能奠定了基础。关键词：北柴胡；发根农杆菌；毛状根：柴胡皂苷；糖基转移酶：原核表达万方数据AbstractBupleurumchinenseDC．iSknownasonesourceofRadixBup

8、leuri，withsaikosaponinsasitsmajorbioactivecomponents．Uridinediphosphate(UDP)glycosyltransferaseareinvolvedinthemodificationofthetriterpeneskeleton，whichcontdbutetothediversityofsaikosaponins．ThegeneBcUGTlowasshowntobecandidatesinvolvedinthebiosynthesisofsaikosaponins．Thepresent

9、workwasfollow—upbio—functionanalysisofBcUGTIOwhichwast