发根农杆菌k599侵染黄瓜形成转基因毛状根初步地研究及orf14基因克隆

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1、0IllIlllllUlUlllllllllllllll$IllllllY2132082生塞淦塞题旦；发褪盛盘菌K量窆窆堡鎏黄丛坦盛莹基旦垂达褪鲍塑生盈究及坌丝望基因煎直隆论文作者签名：指导教师签名：论文评阅人1：评阅人2：评阅人3：评阅人4：评阅人5：答辩委员会主席：委员1：委员2：委员3：委员4：委员5：答辩日期：杭州师范大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过

2、的研究成果，也不包含为获得杭州垣菹太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解楦划堙菹太堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权杭捌垭菹太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学

3、位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月型竖塑型塑一鍪塑——————————————。—‘————————————————————————————————————————————————一．一】*q】致谢时光如驹，三年的研究生生活已近尾声，在学业即将完成之际，特借此机会向三年来给予我关心和帮助的每一位老师和同学表示深深的感谢。首先，我要衷心感谢我的指导老师向太和教授!本论文是在向老师的悉心指导和大力支持下完成的。无论是在论文的选题、构思和资料的收集方面，还是在论文的研究方法以及成

4、文定稿方面，都得到了向老师耐心细致的指导和无私的帮助，特别是他广博的学识、深厚的学术素养、严谨的治学态度和一丝不苟的工作作风使我受益终生。不止在科研学习中，在生活上，向老师也给了我很多建议和指导，为我今后的人生指明了方向。祝愿向老师在学术领域取得更大的成就，培育更多的人才。同时，我要感谢王利琳教授、王慧中教授、庞基良教授、沈波教授、金孝峰副教授等在专业课学习上对我的指导；感谢俞美琴老师、任山章老师等在研究生事务上给予我的的关心和照顾；感谢张道祥、孟莎莎、李佩菡、杜苏瑞、王沙沙等同门在实验和生活上

5、对我的帮助，感谢沈少华、徐京、周国艳、贾飞飞、陈博、王珍华、李颖、鲍林文等同学在我遇到困难时给予我的帮助，是你们的存在才使我的研究生生活如此美好。感谢室友阳广凤、王鸿杰、周硕在生活点滴中带给我的快乐与感动。谢谢你们，让我在杭师大度过了忙碌而又幸福的三年。感谢父母这些年来对我的学业和生活上的支持，感谢他们对我的宽容，感谢兄弟姐妹们对我的关心照顾，祝福所有人健康快乐!曹庆丰2012年5月22日原书空白页不缺内容杭州师范大学硕士学位论文摘要摘要发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes

6、)侵染植物外植体能诱导产生转基因毛状根(hairyroot)。获得的毛状根起源于单细胞而无嵌合体，并能在无植物激素的培养基上自主性快速生长。毛状根可直接作为植物根部线虫等病虫害的宿主；还可应用于环境修复；也可以作为生物反应器，用于生产外源基因表达的蛋白产物和药用植物的活性成分。毛状根是发根农杆菌Ri质粒中的T-DNA插入、整合到植物细胞基因组中表达的结果。转基因植物中外源基因的稳定遗传和高效表达是毛状根具有利用价值的前提条件。本研究利用发根农杆菌K599侵染黄瓜不同外植体获得毛状根，对T-DNA

7、在毛状根中整合的完整性进行了分析；并对长期培养的毛状根中外源基因的稳定性及其表达进行了分析；此外，从发根农杆菌K599中克隆了其T-DNA上的offl4基因，构建了pRll01一AN—orfl4．g币植物表达载体，D∥4基因与gfp形成融合蛋白，便于o,f14基因功能的分析。主要研究结果如下：1．利用发根农杆菌K599(属于黄瓜碱型，带内生质粒pRi2659和外源质粒pRIl01一AN．gfP)侵染黄瓜不同外植体，其中活体下胚轴和上胚轴的生根效率最高，诱导率均达到了100％。同时获得了较细、分枝

8、多、生长快(I型)，粗壮、分枝少、生长较慢(II型)两种不同形态的毛状根。本研究建立了一种快捷、高效的毛状根诱导方法，而且为毛状根发生的分子机理的研究以及T-DNA整合规律与毛状根形态相关性的研究提供了材料。2．对30个独立培养的毛状根根系，进行了PCR检测，分析了T-DNA在毛状根中整合的完整性。内生质粒pRi2659T-DNA上的11个基因D啦．D帕，D矽．D卯．roM．rolB．rolC．rolD．rolE。offl4。CIIS以及外源质粒pRll01一AN-gfpT-DNA上的外源基因g