北玄参组织培养及毛状根培养体系的建立

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1、分类号Q945.5学校代码10233密级公开学号10233120711硕士研究生学位论文题目:北玄参组织培养及毛状根培养体系的建立学科门类:理学一级学科:生物学二级学科:植物学研究方向:植物细胞工程研究生:薛巨坤指导教师:纪春艳教授答辩日期:2015年6月14日摘要北玄参（Scrphulariabuergeriana）为玄参科玄参属草本植物，是重要的传统药材。在中国北方一直以来用北玄参替代玄参入药，有悠久的入药历史。本研究首先对北玄参种子进行不同的消毒处理，获得无菌苗，统计种子的萌发率和污染率，建立北玄参的无菌体系。然后分别以茎段、叶柄、叶片为外植体，采用正交设计，研究不同植

2、物生长调节剂配比的培养基诱导北玄参愈伤组织、不定芽和生根培养，筛选北玄参组织培养各阶段最佳培养基组成，同时建立了北玄参的高频再生体系。本研究还开展了4种发根农杆菌对北玄参遗传转化条件的研究，建立了北玄参的毛状根培养体系。通过以上研究，结果如下：1北玄参种子比较小，消毒处理比较困难。研究认为直接用0.1%HgCl2灭菌6min就能达到良好的消毒效果，污染率为4.95%，种子萌发率为81.49%；种子萌发均匀，种苗发育正常，生长状态良好。2北玄参无性快繁体系建立以北玄参无菌苗的茎段、叶柄、叶片为试材，诱导产生愈伤组织和不定芽，进而诱导不定根的分化，建立了北玄参的高频再生体系。通过

3、正交设计，适合北玄参离体再生的外植体依次为叶片＞叶柄＞茎段；诱-1-1导外植体再生不定芽最佳培养基为MS+6-BA0.5mg.L+NAA0.2mg.L，诱导率-1-1可达100%，芽增殖培养基为MS+6-BA0.2mg.L+NAA0.2mg.L，增殖倍数为-19.13；诱导生根的培养基为1/4MS+IBA0.2mg.L，生根率100%，平均生根数为11.33；再生植株移栽的成活率为86.96%。3北玄参毛状根培养体系的建立以发根农杆菌A4、R1601、C58C1和ATCC15834这4种菌株进行侵染得到毛状根，根据诱导率的高低，得出最适合诱导北玄参毛状根的农杆菌是A4、R16

4、01菌株。对外植体（叶片、叶柄、茎段）进行筛选，得出幼嫩的叶片较成熟的叶片作为实验材料比较合适。北玄参毛状根诱导的条件是：预培养2-3d，外植体侵染的时间为10-12min，共培养天数为2-3d，最高诱导率可达到90.01%。乙酰丁香酮能够促进发根农杆菌的转化，提高北玄参叶片毛状根的诱导率。AS的浓度为100μmol/L时，其诱导率最高为90.01%，是浓度过高，对外植体叶片的伤害较大，后期外植体很容易褐化，从而降低了毛状根的诱导率。1/2MS液体培养基较有利于北玄参毛状根的生长，在培养基中鲜‐I‐ 重增加倍数最多可达到13.5倍。毛状根PCR检测结果证明，Ri质粒的T-DN

5、A已整合到北玄参毛状根基因组中。4北玄参毛状根在MS＋6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L的培养基上可形成愈伤组织，经过继代之后，愈伤组织出现大量的芽点，分化出芽继续转至无激素的MS培养基上，芽逐渐长大，切下后转至1/2MS+IBA0.5mg/L的培养基上培养2周左右，长出大量的根，移栽成活。关键词：北玄参组织培养植株再生发根农杆菌毛状根PCR检测‐II‐ AbstractScrphulariabuergerianabelongstoScrophularianingpoensisHemslherb,whichisanimportanttraditionalmedici

6、nalherbs.TherehasbeenalonghistorytouseScrphulariabuergerianareplacebuergerianaasthemedicineinthenorthernofChina.ThisstudyhasuseddifferentmethodstodothedisinfectiontreatmentonScrphulariabuergerianaseeds,obtainasepticseedlings,dodatastatisticsontherateofseedgerminationandpollutionrate,establi

7、shedtheasepticsystemofScrphulariabuergeriana.Usingthestemsegment,leafstalk,leavesasexplants,basedonorthogonaldesign,wehavedonesomeresearchonScrphulariabuergerianacallus,adventitiousbudsandrootingculturewithculturemediumofdifferentplantgrowthregulatorcomb