牛蒡毛状根培养体系的建立及次生代谢产物的测定

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1、分类号：R932单位代码：10193密级：学号：2012155硕士学位论文牛蒡毛状根培养体系的建立及次生代谢产物的测定EstablishmentofculturesystemofArctiumlappaL.hairyrootsanddeterminationofthesecondarymetabolites作者姓名：李国新学位类别：医学硕士专业名称：中药学研究方向：中药生物技术指导教师：杨世海教授所在学院：中药材学院2015年5月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中

2、不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、

3、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要为了建立牛蒡毛状根培养体系并高效合成次生代谢产物，本文通过利用发根农杆菌R1000、R1、R15834三种菌株来对牛蒡外植体进行诱导，通过对外植体的选择、侵染时间、预培养和共培养时间、不同菌液

4、浓度、培养基pH值等的检测，优化出最佳诱导牛蒡毛状根体系，通过对诱导出的牛蒡毛状根进行PCR检测，确认Ri质粒中的T-DNA整合到基因组中，从培养出的毛状根中筛选长势好的的根系，进一步液体扩大培养，对毛状根扩大培养的条件进行优化。通过毛状根生长曲线、液体培养基的筛选以及不同碳源影响的研究，筛选出最适牛蒡毛状根生长的液体培养基；通过高效液相色谱法检测牛蒡毛状根中牛蒡苷的含量，与牛蒡子、牛蒡根进行牛蒡苷含量对比。通过正交设计优选出提取牛蒡毛状根中牛蒡苷的最佳提取条件。试验结果表明选择发根农杆菌R1对牛蒡根部进行毛状根诱导，对愈伤组织侵染12min后，进行预培养48h共培

5、养36h，在浓度为0.8、pH值为6.5的培养体系中诱导毛状根，通过PCR检测到T-DNA已整合到基因组中；进一步液体扩大培养时，选择White培养基，加入蔗糖作为碳源，培养周期为28天最适宜；对牛蒡毛状根、原植物牛蒡子、牛蒡苷进行HPLC含量检测对比结果显示，牛蒡毛状根中牛蒡苷最高，是牛蒡子中牛蒡苷含量的1.16倍，并用正交试验对牛蒡毛状根中牛蒡苷提取进一步优化，得到最佳工艺为：乙醇体积分数为80%，料液比为1:20，超声提取时间为30min，此条件下，牛蒡苷的提取率为7.345%。关键词：牛蒡；发根农杆菌；毛状根；正交试验IIAbstractTheculture

6、systemofArctiumlappaL.hairyrootswasestablishedandefficientsecondarymetaboliteswereextracted.Inthispaper,AgrobacteriumrhizogenesR1000,R1,R15834wereselectedtoinducethehairyroots,theselectionoftheimplant,theinfectiontime,cultureandco-culturetime,differentbacterialiquidconcentration,medium

7、pHvaluedetectionwereinspected,optimizingthebestinductionsystemofArctiumlappaL.hairyroots.ThentheArctiumlappaL.hairyrootsweretestedbyPCR,T-DNAfromRiplasmidwasconfirmedtointegrateintothegenome.Thebesthairyrootswerechosentofurtherexpandbyliquidcultivationandtheconditionwasoptimized.Byha