虎杖悬浮培养体系的建立及次生代谢调控的初步研究

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1、中国科学院研究生院‘硕士学位论文’■’虎枝悬浮培养体系的建市致敬生代谢调拧

2、1f』衲步研究。—型坠生一镕导教帅☆p一0T’’崩q蒲掌恤衄剖堡圭}科#业躬称——』坚兰!丝一论，=提交日期．!!!生塑：婴论立善辩r]期——型堕坠旦!培井啦位±鲤型芏堕点垄些芏塑型!!塞堕学口授Pq怔．呈8型芏堕丛生：==堕蒋辩萱鄙2+*生【_．差摘要摘要本论文建立了中药虎杖(PolygonumcuspidatumSieb．etz)的悬浮培养体系，通过考察重要理化因子及常用的诱导子对体系生长及代谢的影响，确定了基本培养条件及生产条件；此外还考察了各种

3、理化因子对愈伤组织诱导及次生代谢能力的影响。首先，以源于虎杖茎外植体的愈伤组织建立可继代培养的悬浮培养体系，确定继代培养所需的基本条件为：培养基MS+O．5mg／L2,4一D+O．8mgm6-BA+30g／L蔗糖；摇床培养，转速100rpm；接种密度1009／L；温度25+_2。C；光照14h／day，300ItEm’1S～。在为期20天的连续培养过程中，细胞最大生长量在第7天获得，胞内总酚和总黄酮的合成是生长非偶联型的。其次，通过考察包括激素、基础培养基、接种密度、蔗糖浓度和光照周期等在内的重要理化因子对悬浮培养体系生长及代

4、谢的影响，确定了适宜的生产培养条件为I／2MS+0．25mg／LNAA+0．5mg／LKT+30∥L蔗糖；通过诱导子筛选确定考察范围内的最优诱导条件为20Bmol／L的茉莉酸(JA)。在继代培养条件的基础上，应用生产培养基及20Ⅲnol／LJA诱导子，可使虎杖悬浮培养体系的总酚和总黄酮产量分别提高11和21倍。论文最后从外植体、培养基及光照等方面系统地考察了影响虎杖愈伤组织诱导及次生代谢能力的因素。所考察的三种外植体中，叶外植的愈伤组织诱导率最高而源于根外植体的愈伤组织具有最好的次生代谢能力。所考察的6种培养基中，MS+O，5

5、mg／L2,4—13+1．Omg／L6-BA和N6+O．5mg／L2，4．D+1．0m【g／L6-BA对于愈伤组织的诱导和次生代谢产物的累积都有较优表现。关键词：虎杖，组织培养，细胞培养，代谢调控，培养基优化，诱导子AbstractXiaoqinLiu(BiochemicalEngineering)SupervisedbyProf．WeiZhangCellsuspensioncultureofaChineseherbalplant，P0090numcuspidatumSieb．etZwasestablishedinthisst

6、udy．Keyfactorsincludingmediumformulation．cultureconditionsandelicitorswereinvestigatedforoptimalcellgrowthandsecondarymetaboliteproduction．Effectsofexplantstypesonthemetaboliccapacityofinvitrocellcultureswerealsotested．CellsuspensionculturesofP．cuspidatumwerefirstly

7、establishedfromstemexplants—derivedcallusinMSmediumsupplementedwith0．5mg／L2，4．D，0．Smg／L6-BAand30g／Lsucroseat100rpm，25+_2。Candlightintensityof300I_tEm‘1S—withaphotoperiodof14h／day．Inakineticsstudyof20dayscellculture．themaximumbiomasswasobtainedOnday7．Theproductionofb

8、othtotalphenolicsandflavoneswasuncoupledwithcellgrowth．Tooptimizethecellgrowthandmetaboliteproduction，theeffectofphytohonnonecombinations，basalmedium，inoculumdensity,sucroseconcentrationandphotoperiodwasstudied．TheoptimalmediumformulationwasfoundtobeI／2MS+0．25mg／LNA

9、A+0．5mg／LKT+30g／Lsucrose．Amongfourdifferentelicitorstes把d，Jasmonicacid(JA)at209mol／Lwasprovedt0bethebesttomaximizetotalphenolicsandflavone