西兰花毛状根的诱导及扩繁体系的建立

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1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文西兰花毛状根的诱导及扩繁体系的建立InductionofHairyRootbyAgrobacteriumrhizogenesandEstablishmentofCultureSystemofBroccoli赵生琴指导教师姓名李胜教授（甘肃农业大学兰州730070）学科专业名称发育生物学研究方向植物细胞工程论文答辩日期2015年5月31日学位授予日期2015年6月答辩委员会主席王鸣刚教授评阅人王新宇教授杨宁教授2015年6月甘肃农业大学2015届硕士学位论文摘要西兰花含有丰富的营养成分(蛋白质，脂肪，维生素C等)和矿物质(钙

2、，磷，铁，钾，锌，锰等),含量高于十字花科的白菜花。其中，西兰花中的抗癌物质萝卜硫素，有较高的防癌、抗癌作用。此外，西兰花具有增强机体免疫力、促进生长、增强血管韧性等功效。由于西兰花具有丰富的药理作用，所以其市场需求量也越来越大。但是，由于西兰花的育种方式复杂、周期长，且受自然种植条件的限制，传统的种植技术对植物的产量和质量都有很大的影响。在药用植物研究领域，利用农杆菌介导植物外植体，诱导毛状根培育新品种，从植物源中提取活性成分，已成为研究的热点，且部分毛状根中次生代谢产物含量高于母本植物。试验通过对毛状根的诱导条件（发根农杆菌菌株、外植体种类的选择，以及预培养时间、菌液浓度、浸

3、染时间、共培养温度与时间、除菌方法）和毛状根的培养条件（培养基类型、培养基中碳源和外源激素）等的优化，得到如下的研究结果:1.西兰花毛状根培养体系的建立（1）利用发根农杆菌ATCC15834和ATCC11325菌株对西兰花叶片进行浸染,以得出的毛状根诱导率为指标，发现诱导西兰花毛状根较适宜的菌株为农杆菌ATCC15834，其诱导率可达64.82%。（2）对西兰花叶片、茎段外植体进行发根农杆菌浸染时，发现较成熟且不易老化的叶片作为实验材料时有较高的诱导率（62.42%）。2（3）将生长15d左右的西兰花无菌种子苗叶片剪成0.5cm大小，接种于MS基本培养基进行预培养0、1、2、3、

4、4、5、6d，得出叶片预培养4d时，毛状根诱导率达最高，为69.12%。（4）将经过预培养的叶片进行农杆菌ATCC15834浸染，在农杆菌菌液OD600值为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9时进行浸染，结果表明，当OD600为0.5条件下有最高的毛状根诱导率，为64.18%。（5）通过浸染时间、共培养时间的实验，得出当浸染时间为5min，共培养时间为4d时，均有较高的诱导率，分别为71.82%，65.45%。（6）经过浸染的叶片放置于添加乙酰丁香酮(AS)的培养基进行培养时，一定浓度的AS能提高植物毛状根的诱导率。通过AS浓度为0、50、100、150、200、250μmol

5、/LI甘肃农业大学2015届硕士学位论文的实验筛选，得出当AS浓度为100μmol/L时有最高的诱导率，为66.59%。（7）经过浸染、共培养后的受体叶片由于附带有农杆菌，需在MS+250mg/L羧苄青霉素二钠(CB)的除菌培养基中进行培养，每5d继代一次，继代2～3次后得到无菌的毛状根，该毛状根可用作液体培养。2.西兰花毛状根的离体培养（1）将长至2～3cm的无菌毛状根转接至不同的液体培养基中进行培养，得出西兰花毛状根在不同培养基中生长情况有较大的差异，在MS培养基中，毛状根有最高的增殖倍数（9.46倍）。（2）以MS为基本培养基，添加不同质量的蔗糖和葡萄糖，确定毛状根在蔗糖添

6、加量为30g/L时有最高的增殖倍数（9.43倍）。（3）通过添加不同的外源激素实验筛选，得出IBA的添加量为0.5mg/L时，毛状根生长速度最快，其增殖倍数达到最高（10.82倍）。3.西兰花各外植体的萝卜硫素含量检测通过HPLC检测西兰花无菌苗叶片、幼根和毛状根萝卜硫素含量发现，毛状根中的萝卜硫素含量高达2939.159µg/gDW，显著高于叶片和幼根中的含量。关键词：西兰花；毛状根；诱导率；影响因素；萝卜硫素II甘肃农业大学2015届硕士学位论文SummaryBroccoliisrichinnutrientsincludingprotein,lipid,vitaminCand

7、carotene,thecontentofminerals,suchascalcium,phosphorus,iron,potassium,zinc,manganesearehigherthanthatofbrassicaoleracea.Andbroccoliisrichinsulforaphane,whichisakindofanti-cancersubstancesandhashighcancerpreventionandanti-cancereffects,inaddit