边缘细胞的原代培养体系及永生细胞系的建立

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1、华中科技大学博士学位论文边缘细胞的原代培养体系及永生细胞系的建立姓名：陈敏申请学位级别：博士专业：耳鼻咽喉科学指导教师：孔维佳2003.5.1英文缩写索引缩写AQPsEPFLCIsKMCMEMRr_PCR中英文全称水通道蛋白aquaporins蜗内电位endocochtearpotential成纤维样细胞fibroblastlikecell纹内区intrastrialspace缓慢激活延迟整流钾通道slowlyactivatingdelayedrectifierKf+1channel边缘细胞marginalcell最少必需成份培养基minimemessentialme

2、dia逆转录多聚酶链反应reversetranscriptpolymerasechainreaction血管纹strialvascularis边缘细胞的原代培养体系及永生细胞系的建立华中科技大学同济医学院协和医院耳鼻咽喉科研究生陈敏导师孔维佳教授内耳位于颞骨内，活体研究较为困难。细胞培养可以克服这种缺点，提供大量来源一致、性状相近的细胞作为实验材料。内耳细胞培养方面的工作开展较早，可溯及二十世纪五十年代。培养的组织及细胞包括听囊、耳蜗、前庭组织、Corti’S器、颢骨细胞、侧壁组织的血管内皮细胞、血管纹MC、前庭膜的间充质细胞和上皮细胞，乃至前体毛细胞和螺旋神经节细胞

3、。近年来，随着基因工程技术的成熟，稳定表达SV40T抗原温度敏感株tsA58的“永生性”小鼠成为各种细胞系建立的良好实验材料。据此己建立的内耳细胞系有听囊、耳蜗、椭圆囊、Corti’S器以及椭圆囊上皮细胞系。这些细胞系多数取材于胚胎期或出生后早期，功能上尚未完全成熟，主要用于听、平衡感觉毛细胞的分化研究。内淋巴是内耳毛细胞发挥机械一电转导功能的必要微环境，具有高难电位(Endocochlearpotential，EP)、高K+、高渗透性的电化学特征，这些特性的维持有赖于耳蜗的侧壁组织功能的正常发挥。侧壁组织主要由血管纹(strialvascularis，SV)和螺旋韧

4、带(spiralligament)两部分组成，是内、外淋巴以及血、迷路之间的屏障。血管纹主要由边缘细胞(marginalcell，MC)、中间细胞、基底细胞三种细胞和穿插的毛细血管网组成。螺旋韧带主要由不同的成纤维细胞组成，根据所在部位不同，又分为I—V五个亚型。一般认为，血管纹，特别是边缘细胞，在内淋巴的生成中起重要作用。组织学、生化及电生理等多方面的研究证实，边缘细胞具有跨上皮转运功能，基底膜、顶膜上存在着不同的离子泵、通道等，如：基底膜上的Na，K--ATPase、N“ⅪCl共同转运子、Cl通道；顶膜的IsK通道、非选择性阳离子通道。离子转运的大致过程为：经Na

5、JK／CI共同转运子进入MC基底部的Na+，经Na，K—ATPase以Na：K(3：2)的比例泵出MC；进入的CI’则被Ci通道转运出MC；导致MC内呈现高K+、正电位的状态，而顶端的IsK通道、非选择性阳离子通道等则运出K+，并最终导致电化学平衡。根据这种假说，MC近基底部的外侧，即血管纹内区域(intrastrialspace)应该为负电位，但研究发现该区存在正电位。与前庭比较学研究发现，莳庭区的内淋巴仅具有高K+的特征；高正电位特征的缺如对这种假说也提出了质疑。到目前为止，MC在维持耳蜗内环境稳定中的生理功能及某些疾病发生发展中的病理作用仍未完全阐明。值得注意的

6、是，作为内淋巴的主要组成成分一水一的代跗研究在相当长时间内未引起足够重视。一般认为，水随着离子的转运，顺着渗透压梯度被动进入内淋巴。1988年，Agre等在红细胞膜上发现了一个28KD的跨膜蛋白，随后的⋯系列功能研究让实其为水通道蛋白(aquaporin，AQP)，从此也确认了细胞膜上存在上动转运水的水通道蛋白的理论。目前已发现10种AQPs，具有组织分布的差异性，它的功能有两方面：近等渗性的跨上皮的水的快速吸收／分泌；受渗透压梯度驱动的水转运。近}‘年来，AQPs在内『嘲【织的分布引起了研究者的极大兴趣，但由于实验方法(免疫组化、原位杂交及RT-PCR)、实验动物等

7、的差异，各家报道不一，对于AQPs分布的功能意义的研究更是处于起步阶段。鉴于MC在内淋巴生成中的重要作用，研究其上是否存在AQP，何种AQP，对探讨梅尼埃氏病等与内淋巴代谢紊乱有关疾病的发病机制、治疗均有晕要意义1989年，Rarey等首次采用消化法，利用牛耳蜗侧壁组织进行了MC的原代和短期传代培养，随后，国外一些学者采用组织块法，相继建立了豚鼠、大鼠、沙土鼠MC的原代培养体系。1998年，Belyantseva等利用“永生性”小鼠，建立了m管纹来源的细胞系SVK一1，具有上皮的形念特征、表达紧密连接蛋白，但是缺乏MC的特异性标志物IsK。目前SVK