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时间：2019-05-24
《猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、营养研究《饲料工业》·2010年第31卷第1期 猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立 职爱民左建军黄志毅邹仕庚冯定远 摘要用机械刮取小肠粘膜加胶原酶Ⅱ消化的方法，采用新生未吮乳仔猪小肠组织，成功地分离了猪小肠粘膜上皮细胞（Intestinalepithelialcells,IEC）且在体外培养传代，并采用碱性磷酸酶和角蛋白免疫学试验鉴定，结果表明：体外培养的猪IEC在
2、DMEM-F12培养基中，细胞在1~2d贴壁，5~6d形成细胞克隆，9~11d融合成片；碱性磷酸酶和生物素标记的细胞角蛋白抗体鉴定结果显示90%培养的细胞为阳性，分别从生化的角度证明和细胞生物学角度鉴定了所培养的细胞为IEC。关键词猪；小肠粘膜细胞；原代培养中图分类号S828肠粘膜上皮细胞(Intestinalepithelialcells,IEC)是省原种猪场。肠道的重要功能细胞，参与肠道食糜的消化、吸收、免1.2主要仪器设备与试剂疫屏障和应激反应等，并与肠道的内、外分泌功能关NU-2500型CO2细胞培养箱(N
3、uaire公司，美国)；系十分密切。长期以来，在研究IEC的生物学功能、细IX70型倒置生物显微镜(Olympus公司，日本)；5804R胞增殖和分化的调控因素，物质吸收与代谢等多采用型高速大容量冷冻离心机(Eppendorf公司,德国)；SW-[1]肠道肿瘤细胞系为试验模型。然而癌细胞是非正常CJ-1F型超净工作台(苏州净化，中国)；HVE-50型高的细胞，其生理特征明显不同于正常细胞，单纯由癌压蒸汽灭菌锅(HIRAYAMA公司，日本)；GF-M2000型细胞系的研究结果来解释正常细胞的行为，明显有其酶标仪（山东
4、高密彩虹仪器公司）；CS101-2AB型鼓风不足。原代培养是从供体取得组织细胞后在体外进行干燥箱(重庆试验设备厂)；79-1型磁力加热搅拌器(江的首次培养，原代培养的细胞生物学特性变化较少，苏金坛荣华仪器总厂)；Orion420A+型酸度计(Thermo最能反映和接近体内生长特性，是一种良好的试验载Electron公司，美国)；DMEM培养基、胎牛血清、胰酶[2]体。国外早在1993年就有猪肠细胞原代培养的报道，和胶原酶Ⅱ型(Gibico公司)，标准胎牛血清（杭州四季[3-5]其它类型的猪组织细胞原代培养的报道也不
5、少，国青公司），青霉素、链霉素、β-甘油磷酸钠、硝酸钴、硫内关于动物体细胞原代培养的报道多集中在其它动化铵(Sigma公司)，NaCl、KCl、NaH2PO4·12H2O，K2HPO4、[6-9]物身上，而关于猪IEC原代培养的方法一直属于空丙酮、硝酸钙、硫酸镁等试剂均为国产、分析纯。白。本试验的目的就是通过机械和酶消化结合的方法2试验方法建立猪IEC原代培养的系统，为猪肠道营养的研究提2.1猪IEC的分离培养供新的试验材料。2.1.1主要试剂配制1试验材料按照说明书配制DMEM-F12不完全培养基，1.1试验动物
6、0.22μm过滤除菌，分装，4℃避光保存备用。1gⅡ型新生杜×长×大三元杂交仔猪（未吮奶），购于广东胶原酶干粉溶于100ml上述配好的DMEM-F12不完全培养液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，1.5mlEppen-dorf管以1ml/管分装，-20℃保存备用。DMEM-F12完全培养基为DMEM-F12不完全培养基加10%的胎职爱民，河南省农业科学院农业部动物免疫学重点开放实验室，博士，副研究员，450002，河南省郑州市农业路1号。牛血清。左建军、黄志毅、邹仕庚、冯定远(通讯作者)，华南农业大2.1.2猪IEC
7、的分离[10－11]学动物科学学院。参照文献报道的方法并根据实际情况调整,收稿日期：2009-10-26具体如下:将刚出生未吮乳的仔猪颈动脉放血处死,★国家重点基础研究发展计划项目(2004CB117501)、广东联合75％的酒精擦洗消毒后，置于超净工作台。无菌条件基金项目(No.u0731004)和博士点基金项目(20070564014)下打开腹腔,整体分离肠道,迅速投入盛有15ml37℃资助预热DMEM-F12不完全培养基的平皿中；分别取十10职爱民等：猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立营养研究二
8、指肠、回肠和空场各15cm左右，沿纵向剪开，培养PBS洗细胞2min×3次；吸去多余的PBST,加50μl封基冲洗三遍并用玻片轻轻刮去表面杂物；清洗后的培闭液于孔中,37℃孵育10min；吸干液体,并用PBST养基转移到新的盛有15ml37℃预热DMEM-F12不洗2min×3次；每孔细胞加100μl的一抗（鼠抗人角完全培养基的平皿中，取出小肠，DMEM-F
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