人头发毛囊角质细胞原代培养及其ips细胞的建立

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1、UDC570硕士学位论文学校代码密级10533人头发毛囊角质细胞原代培养及其iPS细胞的建立ThegenerationofhumaniPScenlinesderiVedf．romprimaryhairf．olliclekeratinocytes作者姓名：祝斌学科专业：生物学研究方向：细胞生物学学院(系、所)：肿瘤研究所指导教师：任彩萍教授论文答辩日期答辩委员会主席中南大学2013年5月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含

2、为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：——导师签名——日期：——年一月一日本课题受以下基金资助：三项国家自然科学基金资助，批准

3、号：81070993、30871246、30200140973项目，批准号：2010CB833605教育部新世纪优秀人才，项目编号：NCET-10．0790湖南省自然科学基金，项目编号：07JJ30388中文摘要人头发毛囊角质细胞原代培养及其iPS细胞的建立摘要目的：(1)建立稳定、高效的人头发毛囊角质细胞原代培养体系，为iPS细胞的基础研究和临床应用提供稳定的细胞来源。(2)建立诱导人头发毛囊角质细胞重编程的技术体系，为建立病人特异性的iPS细胞奠定技术平台。方法：1．采用贴壁法和酶消化法分离人头发毛囊角质细胞，并使用有饲养层培养法和无饲养层培养法在体外进行原代培养。

4、2．RT-PCR鉴定人毛囊角质细胞CKl4的表达。3．使用单双酶切鉴定慢病毒质粒。4．慢病毒的包装及病毒产生的鉴定。5．使用慢病毒感染人头发毛囊角质细胞。6．iPS细胞的鉴定：通过形态学观察、RTIPCR、核型鉴定、W-estemblotting实、碱性磷酸酶底物染色等技术方法检测iPS的生物学特性；并检测本室新克隆的在人ES细胞中特异性高表达的人类新基因ESRG(humanemb巧onicstemcellsrelatedgene，ESRG)在人头发毛囊角质iPS细胞中的表达。结果：’1．采用有饲养层和无饲养层培养方法培养人头发毛囊角质细胞。通过RT-PCR鉴定结果表明

5、体外原代培养的人毛囊角质细胞表达CKl4基因。2．首次采用饲养层贴壁培养法，使人头发毛囊角质细胞的原代培养成功率达到80％。3．使用单双酶切鉴定后，通过凝胶电泳图显示，各个质粒条带的大小与质粒信息一致。4．将病毒包装质粒与目的质粒共转染293T细胞，24~48h后在倒置荧光显微镜下可观察到EGFP蛋白荧光、合包体和细胞融合现象，表明细胞正在产生病毒。5．用293T细胞模型验证慢病毒系统能正常高效地表达。6．用慢病毒载体法重编程人头发毛囊角质细胞，第15天开始，可见到人ES细胞样的克隆出现。7．通过检测，所得的iPS细胞具有以下生物学特征：(1)具有人ES细胞形态特征；(

6、2)内源性表达ES细胞特有的标志基因；(3)表达ES细胞标志蛋白Oct4和Sox2；(4)表达新基因ESRG：(5)碱性磷酸酶染色呈阳性；(6)具有体外分化形成囊性拟胚体的能力；(7)具有正常的二倍体核型。II结论：1．建立了稳定、高效的人头发毛囊外根鞘角质细胞原代培养体系，为iPS实验研究提供了便捷的细胞来源。2．通过携带Oct4、Sox2、Ⅺf4和c—Myc基因的慢病毒载体可以将人头发毛囊角质细胞重编程成为iPS细胞，具备人ES细胞的各种生物学特性。在体外培养和传代过程中能够维持这些生物学特性。上述实验结果初步证明我们已经建立了人头发毛囊角质iPS细胞系，为将来人头

7、发毛囊角质细胞来源的iPS细胞实验研究和临床应用奠定了技术平台。关键词：慢病毒载体法，人头发毛囊角质细胞，诱导性多潜能干细胞，人胚胎干细胞，重编程III硕士学位论文英文摘要ThegeⅡerationofhumaniPSceUlinesderivedfromprimaryhairf-olliclekeratinOcytesAbstr￡lct：ObjectiVes1)7r0supplyasuf!ficientsourceofkeratinocytesforiPSexperiments，weaimforesta_blishingamoredef