毛囊细胞高效分离培养方法的建立-论文.pdf

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1、2014年9月第31卷第5期广州中医药大学学报September2014，Vo1．31，No．5JournalofGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine807．基础研究．毛囊细胞高效分离培养方法的建立陈杏晔，李凡，刘爱军(1．广州中医药大学基础医学院，广东广州510006；2．广州中医药大学组织学与胚胎学教研室，广东广州510006)摘要：【目的】建立一种简单易行、高效稳定、细胞活性好的毛囊细胞分离培养方法。【方法】无菌条件下剪下sD乳鼠触须部皮肤，拔出单个毛囊。采用I型胶原酶、胰酶两步

2、法消化毛囊，细胞悬液接种于细胞外基质包被的培养板中．以体积分数1％胎牛血清的K—SFM培养液培养，次日换无血清培养液。剩余组织块剪碎铺展于培养瓶中．添加含血清的HG—DMEM培养基常规培养取以上2种细胞进行免疫荧光鉴定。毛囊上皮细胞进行流式细胞仪检测。【结果】两步酶法分离得到的毛囊上皮细胞贴壁迅速，圆形或多角形，呈典型铺路石状。培养的组织块周围有长梭形细胞爬出，细胞有突起，并连接成网状毛囊上皮细胞CK15、CK19、131整合素表达阳性，以G1期细胞为主．占75．6％。毛囊结缔组织鞘细胞的层粘连蛋白、纤维连接蛋白、波形蛋白表达阳性。【结论】分

3、离培养的细胞为毛囊干细胞和成纤维细胞，该方法得到的细胞贴壁快、均一性好、增殖能力强。关键词：毛囊干细胞／病理学：成纤维细胞／病理学：分离：细胞培养中图分类号：R392．12文献标志码：A文章编号：1007—3213(2014)05—0807—03DoI：10．13359／j．cnki．gzxbtcm．2014．05．027理想的组织工程皮肤(tissueengineeringskin)CK19)、131整合素、层粘连蛋白(1aminin，LN)、纤是同时含有表皮和真皮2种组织结构的全层人工皮维连接蛋白(fibronectin，FN)、波形蛋白

4、肤．对临床治疗大面积烧伤或深度溃疡等皮肤缺损(vimentin)(北京博奥森生物技术有限公司)；Ⅱ抗患者具有重要意义【”毛囊是皮肤中重要的附属器生物素化羊抗兔IgG和链霉亲和素—生物素复合物官．毛囊上皮根鞘中的毛囊干细胞(hairfolliclefSABC—Cy31试剂盒(武汉博士德生物工程有限公stemcells．FSC)和结缔组织鞘中的成纤维细胞积司)；细胞周期试剂盒(cat#CCS012，Lot#3223803，极参与了创伤后皮肤的修复重建．可作为种子细胞杭州联科生物技术有限公司)；PBS缓冲液(杭州参与组织工程皮肤的构建闭本研究旨在建

5、立一种吉诺生物医药技术有限公司)：IX71倒置荧光显微简便、高效、易行的乳鼠触须部FSC和成纤维细镜(日本O1ympus公司)；BDAccuriC6流式细胞仪胞分离培养方法．为构建理想的组织工程皮肤提供(美国BD公司)：TDZ5一WS低速离心机(长沙平种子细胞凡仪器仪表有限公司)1．3毛囊获取取9只乳鼠浸泡于体积分数75％1材料与方法乙醇中充分消毒无菌条件下剪下触须部全层皮1．1动物SPF级sD乳鼠．由广州中医药大学肤。取含100U／L青霉素、100mg／L链霉素的PBS大学城校区实验动物中心提供，合格证号：清洗2次．再取适量PBS洗至溶液无

6、血色。采用44005900000539。许可证号：SCXK(粤)2013—钟表镊从真皮侧中拔取生长期毛囊0020．出生1～3d。体质量4～6g1．4组织块的接种取上述已拔去毛囊的组织块1．2主要试剂与仪器I型胶原、胰蛋白酶和核剪碎(<1mm3)，将其铺展于25emz培养瓶中。加标记物二脒基苯基吲哚fDAPI)(美国Sigma公入含体积分数10％胎牛血清的HG—DMEM培养液．司)：HG—DMEM培养基和青链霉素混合液(美国常规培养。Hyclone公司)；I型胶原酶、胎牛血清、K—SFM1．5l型胶原酶消化将毛囊组织置于离心管培养基『含重组表皮

7、生长因子(rEGF)、牛垂体提取中。加入1g／LI型胶原酶(毛囊组织与胶原酶体物(BPE)】(美国Gibco公司)；I抗、角蛋白15积比为1：3)，37℃、体积分数5％的C0培养箱中(cytokeratin15，CK15)、角蛋白19(eytokeratin19，消化15min，吸管吹打30S，继续消化15min。收稿日期：2O14一O3—17作者简介：陈杏哗(1989一)，女，硕士研究生；E-mail：564533227@qq．com通讯作者：刘爱军，女，博士研究生；E-mail：761650401@qq．eom基金项目：国家自然科学基金资

8、助项目(编号：81102675)808广卅l中医药大学学报2014年第31卷1．6胰蛋白酶消化吸出胶原酶．PBS充分洗涤后除去多余PBS加入2．5gm胰酶于培养箱中