大鼠再生肝细胞的分离和培养-论文.pdf

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1、四川动物2014年第33卷第3期SichuanJournalofZoologyVo1．33No．32014DOI：10．3969／j．issn．1000—7083．2014．03．023大鼠再生肝细胞的分离和培养杨军英，刘芳，李涛，刘慧兵(1．河南师范大学生命科学学院，省部共建细胞分化调控重点实验室，河南新乡453007；2．河南师范大学体育学院，河南新乡453007)摘要：建立大鼠2／3肝切除模型，分别于术后恢复0h．6h、12h、24h、48h、72h、120h、168h等时问点，采用原位胶原酶消化和密度梯度离心法分离、纯化再

2、生肝细胞，获得的再生肝细胞活性95％以上，纯度96％以上。用DMEM培养液添加其他物质后培养再生肝细胞，在培养的96h内，肝细胞生长状态良好，具有分泌白蛋白和合成尿素的功能。细胞的DNA合成主要在培养24h以后，72h时达到高峰。关键词：大鼠；再生肝细胞；细胞培养；白蛋白；尿素；DNA合成中图分类号：Q2—33；Q959．837文献标志码：A文章编号：1000—7083(2014)03—0440—05IsolationandCultureofHepatocytesfromRegeneratingLiverofRatYANGJuny

3、ing，，LIUFang，LITao，LIUHuibing(1．CollegeofLifeScience，KeyLaboratoryforCellDifferentiationRegulation，HenanNormalUniversity，Xi~xiang，HenanProvince453007，China；2．CollegeofPhysicalEducation，HenanNormalUniversity，Xinxiang，HenanProvince453007，China)Abstract：Hepatocytesofratt

4、reatedbypaaiMhepatectomyafter0h，6h，12h，24h，48h，72h，120h，and168hwereisolatedandpurifiedbycollagenasedigestionanddensitygradientcentrifugation．Theviabilityofregeneratedhepato—cyteswasover95％，andthepuritywasmorethan96％．TheregeneratedhepatocytesgrowwellinDMEMcontaining10％

5、fetalcalfserum，andwerecapableofsecretingalbuminandsynthesizingurea．DNAsynthesisofhepatocyteswasinitiatedafter24handachievedthepeakat72h．Keywords：rat；regeneratedhepatocyte；cellculture；albumin；urea；DNAsynthesis再生生物学和再生医学的发展使其应用日益广这些方法存在分离肝细胞时间长、细胞纯度和活性泛。肝脏在受到药物、毒素、部分切除或

6、者严重的病相对较低、肝细胞收率不高等问题。因此，作者在前毒性感染等刺激之后，残余肝脏细胞能够迅速增生人研究基础上，利用2／3肝切除模型(partialhepa—恢复至原肝重，维持正常的肝脏生理功能(Fausto，tectomy，PH)，采用两步灌流法和密度梯度离心法分2006)。对于肝细胞再生的研究不仅能揭示肝脏对离、纯化不同恢复时期的再生肝细胞并进行培养，为于损伤的修复机理，用于指导其他器官功能紊乱的揭示肝再生机理以及肝细胞的广泛应用奠定基础。研究(Yamazakieta1．，2011)，还能用于揭示肝癌、肝1材料和方法硬化等肝

7、脏疾病的发生、发展、治疗和修复机理(Hixsoneta1．，2000)。肝细胞是肝脏功能的主要完1．1实验动物及大鼠2／3肝切除模型制备成者，肝细胞再生是肝损伤修复的第一道屏障(Rie—sD大鼠，体重210—250g，由河南师范大学实hieeta1．，2011)。原代培养的肝细胞较好的保留了验动物中心提供。饲养温度21oC±2℃，相对湿度肝细胞分化状态和代谢活性，排除了其他复杂因素60％±10％，光照时间12h／d(8：00～20：00)，自由影响(邓颖等，2006)，在药物代谢、药物毒理学、致饮水、摄食。癌作用、肝病机理等方面的

8、研究非常普遍，也是目前按Higgins和Anderson(1931)方法构建大鼠部肝细胞移植研究的种子细胞之一(Nagaldeta1．，分肝切除模型。乙醚吸人麻醉大鼠，在无菌条件下，2001)。虽然已有一些分离和培养肝细胞的方法，但自剑突下方约1～