鸡离体肝细胞的分离和培养

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1、鸡离体肝细胞的分离和培养作者：杜礼琴摘要：本试验采用不同的方法分离鸡肝细胞，并进行体外培养和观察。试验选用3日龄粵黄鸡和8-21日龄圩冈黄鸡，分别采用0.25哪夷蛋白酶加0.019€DTA不同时间消化、0.1G/骹原酶消化、0.2%胶原酶消化、混合酶消化、先0.29^原酶消化后0.25领夷蛋白酶加O.Oia/CDTA两步消化、先0.25%胰蛋白酶加0.01诜CTA后0.2鄉原酶两步消化、肝组织剪碎培养、组织块0.25祕夷蛋白酶预消化、组织块0.2W原酶预消化、3n^和1n^不同大小肝组织块培养、不同产地胰蛋白酶消化、采用玻璃瓶和塑料瓶培养等试验方法

2、分离培养肝细胞。添加含有1姆鸟胚渗出液和10%台牛血清的DMMF-12完全细胞培养液，于37oC、饱和湿度、5°/CC2的培养箱中长期培养，观察肝细胞的生长增殖状况及形态变化，定期换液并收集上清液，检测白蛋白和胆汁酸的分泌情况，以判断肝细胞的活力。结果表明：先0.原酶消化后0.25%夷蛋白酶加0.01%DTA两步消化培养的方法，分离和培养效果最好，肝脏在培养液中分裂增殖，生长良好，培养时间最长。其次是0.2@原酶消化培养法、0.25%胰蛋白酶加0.01呢CTA消化30mn、0.骹原酶消化培养法、组织块0.25诚夷蛋白酶预消化培养法。塑料培养瓶比玻璃

3、质地培养瓶的更利于鸡肝细胞贴壁和生长。关键词：鸡；肝细胞；离体培养；酶两步消化1前言肝脏是动物机体的重要代谢器官，机体正常的发竹与物质代谢均与肝细胞的功能有关。离体肝细胞培养是研究肝细胞功能的重耍方法之一［1］。尽管哺乳动物肝细胞培养技术的建立已冇许多成功的报道［2,3］,但鸟类的肝细胞培养少见报道，由于鸟类和哺乳类动物在解剖与组织结构上存在较火差异，因此肝细胞的分离培养条件及离体细胞的增殖特性可能具有不同的特点［4］。木试验中我们选川人小两组黄鸡，采川胰蛋0酶消化、胶原酶消化、两步酶消化、肝组织块直接培养和肝组织块酶预消化培养等试验方法，观察鸡离

4、体肝细胞的分离及培养效果，并进行肝细胞分泌功能的检测。细胞在体外能否培养成功，分离技术卒关重耍。常川的分离方法主要冇：机械法、螯合法和酶消化法。早期常川的分离方法是机械法，优点足操作简单，成本低和所分离的肝细胞膜上的缶白成分性质不易发生改变，侃III于细胞间通过桥粒连接等多种联接方式紧密连接及该法对细胞损伤严秉，所以通过机械法获取的肝细胞数S少且活性低。机械法以后的一段时间内，人们乂用可结合Ca2+、Mg2+的螯合剂来分离肝细胞，常用的螯合剂有m）TA、EGTA及柠檬酸盐等，但单独使用螯合剂分离效果差，现常与酶消化法结合使川，以提高细胞的获取率［5

5、］。酶法对肝细胞机械损伤较少，分散细胞的效果也较好。酶法中胶原酶灌注法分离肝细胞所得细胞成活率高，单位肝细胞所获细胞多，但价格喆贵，操作步骤多，技术难度人，且易于污染。而组织块酶消化法分离细胞操作简单，价格低廉，对于大部分试验来说，完全可以获得足够多的细胞以满足实验的要求。随着科学技术的不断发展，建立规范化体外肝细胞分离与培养方法，对诸多离体试验，如病毒转染、药物筛检、疗效评价及组合性人工肝等各方而的研究冇非常重耍的价值［5］,臂如：通过制作鸡肝细胞用于检测TNF-a（肿瘤坏死W子）的靶细胞等等。W此，采用何种方法能获取产率高、活性好、功能强的肝细

6、胞，对于进一少试验研究十分必要。木试验分别采用多种方法分离培养鸡肝细胞并进行原代和传代培养，R在通过观察细胞形态、活性、及功能的变化以比较各种方法的优缺点。2材料与方法2.1试剂DMEM/F-12（Gibco,公司提供）、胎牛血清（特级胎牛血清，由Hyclone公司提供）、自制鸡胚渗出液、4%台盼蓝、胶原酶（Collagenase,曲上海生工提供）、胰蛋白酶（HyQ®TRYPSM,由Hyclone公司提供）、青霉素、链霉素等2.2仪器HZS-H水浴振荡器（哈尔滨市永联电了•技术开发冇限公司）、01ympUSTX70倒置生物显微镜（U本）、玻璃和塑料

7、细胞培养瓶（Conine公司生产）、C02培养箱（美国Nuaire）、400F1细胞筛、台式大容董冷冻超高速离心机（德国eppendorf公司提供）、浄化工作台（HS-1300-u，苏州）等2.3实验动物3U龄的粤黄鸡（由平南农业人学种鸡场提供）、8-21龄的圩冈黄鸡（购&佛山科技学院）2.4肝细胞分离方法将试验鸡去尖放血，75%的泗精消莓移至无菌室，在超净台内无菌打开腹腔，取岀肝脏，置入DMEM/F-12培养液中漂洗儿次，尽量除去血污，然后采用以卜不同方法分离培养肝细胞：2.4.1采用胰蛋白酶消化用眼科剪将肝脏剪成3mm3人小的组织块，用DMEM

8、/F-12培养液反复漂洗三次，分别采用Hyclone公司提供的0.25%胰蛋白酶加0.01%EDTA消化液和自己配制的0.