资源描述：
《大鼠肝细胞分离和原代培养的简易方法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、222江苏农业学报(JiangsuJ.ofAgr.Sci.),2009,25(1):222～224大鼠肝细胞分离和原代培养的简易方法刘学忠,李慧敏,王富民,顾建红,刘宗平(扬州大学兽医学院,江苏扬州225009)关键词:大鼠;肝细胞;分离;原代培养;鉴定中图分类号:Q2233文献标识码:A文章编号:100024440(2009)0120222203ASimplifiedMethodforSeparationandPrimaryCultureofRatHepatocytesLIUXue2zhong
2、,LIHui2min,WANGFu2min,GUJian2hong,LIUZong2ping(CollegeofVeterinaryMedicine,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)Keywords:rat;hepatocyte;isolation;primaryculture;identification体外分离培养肝细胞是人工肝、毒理学、药理学、生理学113鼠尾胶原制备及培养板包被以及基因工程等研究的基础,良好的分离技术是获取高活性11311鼠
3、尾胶原制备取SD大鼠1只,剪断鼠尾,置75%[1]肝细胞的前提。长期以来,国内外普遍采用Seglen的胶原乙醇中浸泡30min,于无菌条件下将鼠尾切成115cm左右酶原位两步灌流法,该法成为分离肝细胞的经典方法,在此的小段,剥去皮毛,抽出尾腱置于平皿中,剪碎以后浸入150[2]基础上又发展了半原位酶分离技术。但该类方法仍存在ml011%醋酸溶液中,4℃冰箱中放置48h,并不时振荡。操作繁琐、流程长、胶原酶耗费大等问题。本研究拟采用胰4000r/min离心30min,吸取上清,经67155kP(1
4、1516℃)酶、胶原酶两步消化法获取肝细胞,以求操作简便,胶原酶用高压灭菌10min后分装,-20℃保存备用。量少,并能满足一般实验室对肝细胞的要求。11312培养板包被取少许胶原加到培养板中,不宜太厚,放到高压过的铝盒中,通入氨气作用15min取出培养板,用1材料与方法无菌生理盐水冲洗,置紫外灯下过夜。111试验动物114大鼠肝细胞分离及培养出生3d的SD大鼠(扬州大学实验动物中心提供)。11411肝细胞分离出生3d的SD大鼠断头处死放入112主要试剂及仪器75%乙醇中消毒10min,无菌条件
5、下取肝脏,置冰冷PBS中,鼠尾胶原(自制);DMEM培养基(Gibco);胎牛血清(杭撕去肝包膜,剪碎后先加入0105%的胰酶,37℃振荡消化20州四季青);胰酶(上海生工,1∶250);IV型胶原酶(Worthing2min,弃去上清后再用0105%的IV型胶原酶37℃振荡消化ton,280U/mg);碱性品红、偏重亚硫酸钠、过碘酸(上海生20min,分别用120目、200目网筛过滤,细胞悬液在4℃条工);二氧化碳培养箱(Healforce);高速冷冻离心机(Jouan/件下800r/min离
6、心3min,反复离心3次。沉积的细胞用含5MR23i)、倒置显微镜(重庆光学仪器厂);XL302ESEM环境10%胎牛血清的DMEM调整细胞密度为1ml5×10个细扫描电子显微镜(Philips)。胞,台盼蓝染色测定肝细胞活力。11412肝细胞原代培养调整好密度的细胞接种在胶原包被的培养板中,培养24h后换液,去掉红细胞。收稿日期:2008206211115过碘酸2雪夫反应鉴定肝细胞基金项目:国家自然科学基金项目(30440050、305713647)11511高碘酸氧化液配制015g高碘酸溶于
7、100ml蒸馏作者简介:刘学忠(19682),男,江苏江都人,博士研究生,主要从事动物营养代谢病与中毒病学研究。(Tel)0514287979042;水中,4℃冰箱保存。(E2mail)xmnkliu@yahoo1com1cn11512Schiff剂配制1g碱性品红溶于200ml煮沸的蒸馏通讯作者:刘宗平,(Tel)0514287991448;(E2mail)Liuzongping@yzu1edu1cn水中,振荡5min,冷却至50℃过滤,并向滤液中加20ml1刘学忠等:大鼠肝细胞分离和原代培养
8、的简易方法223mol/L的盐酸。冷至25℃时加1g焦亚硫酸钠(Na2S2O5)。将此液置暗处12～24h,加2g活性碳,摇动1min过滤,保存于0～4℃,用时恢复室温。11513PAS糖原染色取出肝细胞爬片,用019%的生理盐水清洗2次,每次3min,70%酒精固定10min,高碘酸水溶液反应10min,流水冲洗,蒸馏水洗5min,晒干,置入Schiff试剂中10～30min后水洗3min,自然干燥后镜下观察。116肝细胞形态学观察试验过程中用相差倒置显微镜对分离纯化和接种的肝细胞进行形态学观
