改良的小鼠原代肝细胞分离纯化方法

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1、第28卷第11期南京医科大学学报(自然科学版)2008年11月ACTAUNIVERSITATISMEDICINALISNANJING(Natura1Science)·1437·改良的小鼠原代肝细胞分离纯化方法余莹，张日华，朱自强，王林涛(南京医科大学生物化学与分子生物学系，江苏南京210029；南京医科大学第一附属医院老年科，江苏南京210029)[摘要]目的：建立一种简便、经济、高效的小鼠肝细胞分离和纯化方法。方法：对传统的两步原位胶原酶灌流法进行改进，缩短消化时间和改变灌注方式；分离的小鼠肝细胞，采用低速离b(3oor／min

2、，1min，3—5次)纯化，台盼兰染色检测活率，糖原染色鉴定肝细胞．并与单密度梯度离心纯化法进行比较。结果：原代肝细胞经低速离心纯化后，活率达到90％左右，纯度达95％以上．与密度梯度离心法效果相近。结论：建立了一种新的小鼠原代肝细胞的分离纯化方法。[关键词]小鼠原代肝细胞；原代培养；IV型胶原酶[中图分类号]R329．26[文献标识码]A[文章编号]1007—4368(2008)11-1437—04AnimprovedmethodforisolationhepatocytesofmiceYUYing，ZHANGRi—hua，ZH

3、UZi—qing，WANGLin—tao(DepartmentofBiochemistO"andMolecularBiology"，NJMU，Nanjing210029；DepartmentofGeratology，theFirstAfiliatedHospitalofNJMU，Nanjing210029，China)[Abstract]Objective：Todevelopaconvenient，inexpensiveandefficiencymethodforseparatehigh-purityprimaryhepatocy

4、tesisolationofmurine．Methods：TheimprovedmethodwasusedwithlowconcentrationtypeIVcollagenase．Purifiedhepatocyteswereseparatedfromthedissociativecellsbylow·speedcentrifugation(300r／min，1min，3-5times)．Thesurvivalratewasmeasuredbytypanblueexclusionandthepuritywasmeasuredby

5、PASstaining．Thetime，viabilityandpurityoftwomethodswerecompared．Results：Thecellviabilitywashigherthanthatofcellsobtainedbytraditionalmethod，andthequantityofcollagenaseandthetimeusedwasdecreasedmarkedly．Thepuritywasnearlythesameasthemethodofpercollpurity．Conclusion：Anew

6、methodforseparatehigh—purityprimaryhepatocytesisolationwassullessfullyestablished．[Keywords]mouseprimaryhepatocytes；primaryculture；typeIVcollagenase[ActaUnivMedNanjing，2008，28(11)：1437—1440]肝脏是人体最重要的代谢器官，在多种生理病度梯度离心法【9进行纯化，所得细胞数量多．活力理过程中发挥了重要作用。肝细胞行使了肝脏主要好，纯度高，并且保留了肝细

7、胞的各项功能。该方法的功能，如碳水化合物的转化、胆汁的生成、蛋白质也存在操作复杂，技术要求高，所需时间长．易污的合成及储存等⋯。原代培养的肝细胞广泛用于毒染，经济成本高等缺陷，限制了原代肝细胞在研究理学、药理学[引、生物化学[3]、分子生物学[]相关的研中的广泛应用。本文建立了一种简单易行、经济实究。但原代肝细胞增殖能力差，不易长时间保存[]或用的小鼠原代肝细胞分离纯化方法，为进一步进行长期培养其生物学性状会发生改变I6]。因此建立简相关研究奠定了基础单易行的分离纯化肝细胞的方法显得十分重要。目1材料和方法前采用的Seglen门静

8、脉两步灌流法【7J及其改良的方法I8]分离大鼠原代肝细胞，并联合应用percoll单密1．1材料雄性ICR小鼠(南京医科大学实验动物中心提[基金项目]南京医科大学校基金资助(NY02071)供)，6-9周龄。EGTA、HEPES、IV型胶原酶(Si