小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良

小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良

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时间:2018-11-30

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1、小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良【摘要】目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。方法改良酶消化法。结果用该法培养细胞传代生长快,细胞纯度达98%以上,足以满足各种细胞试验需求。结论与传统方法相比该法简单经济,试验成功率高,节省材料和时间,而且可获得更多纯度较高的细胞。吴建芳(1972~),女,汉族,青海籍,副教授,硕士【关键词】小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养AbstractObjectiveTocreateasimpleandeffectiveprimaryculturemethodsfor

2、mousevascularsmoothmusclecells(VSMC).MethodsReformedenzymaticdigestion.ResultsVSMCorethan98%eetvariouscelltests.Conclusionparingethods,thisapproachescansavemuchtimeandmorematerials,alsohavebettercellquantitiesandpurity.Keyarycult在心血管疾病的基础研究中,对血管平滑肌细胞生物特性的研究是

3、极其重要的一部分,其对揭示血管病变机理至为关键。体外培养平滑肌细胞是常用试验模型,近年来随着细胞培养技术的发展,原代培养的成功率有所提高,但仍然存在许多问题,经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索,不但影响试验进程而且浪费材料,而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的,所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率,并在有限的材料下获得好的结果,我们大胆采用了酶消化法(常规采用组织块培养法),从取材方法及消化步骤等方面进行了改良,试验结果证实该法简单经济,成功率高,细胞生长快,纯度高,现介绍如下。1材料与试剂1.1组织来

4、源:C57BL/6J小鼠(鼠龄8周以后)主动脉。1.2试剂:鼠抗SMC-α-actin,Cy2conjugatedaffinitypurifiedanti-mouseIgG[H/L],戊巴比妥钠注射液。1.3培养基:在DMEM培养基中添加15%胎牛血清、1%青霉素、链霉素、1%谷氨酰胺,过滤除菌备用(不要超过四4周)。1.4酶消化液:CollagenaseTypeⅡ7mg溶于5mlDMEM培养基中(无血清),过滤除菌即用。1.570%乙醇:用无菌蒸馏水配制。1.6器械、仪器:齿、平镊,组织、眼科剪,无菌注射器,

5、培养皿,解剖显微镜(Paxcam,Vistavision),荧光显微镜(LEiCADMI6000B)。2方法2.1常规麻醉小鼠,70%乙醇冲洗颈部和腹部,打开胸、腹腔,暴露心脏。2.25mL注射器穿刺左心室,PBS缓冲液冲洗主动脉。2.3完整分离主动脉,放入100mm无菌平皿,滴1~2滴PBS缓冲液。2.4解剖显微镜下撕去血管外膜至血管光滑透明(如粗糙不平说明外膜去除不干净)。2.5取出血管,放入另一有PBS缓冲液的平皿里,转到超净工作台操作。2.6眼科剪将血管快速剪成1~2mm2大小后用胶原酶消化3~4h(组

6、织块变成细胞团即可)。2.7加入DMEM培养基终止消化并离心倾去上清液,离心管中加入1ml新鲜培养基重悬细胞,接种于12孔培养板中的一孔,常规静置培养。2.8第2天观察是否有细菌污染,如有要更换新鲜培养液,静置培养。于第5、6天细胞生长达培养皿面积的80%左右时可传代,常规方法即可。3细胞鉴定免疫荧光法鉴定平滑肌细胞:常规消化,细胞接种于培养载玻片。第2天用PBS缓冲液轻缓洗涤,加3.7%福尔马林液在室温下固定30min后用PBS缓冲液洗涤3次,2min/次。然后用0.1%Triton-x-100(PBS配制)

7、室温下渗透细胞10min,以便抗体更好的进入细胞。用10%山羊血清(PBS配制)封闭非特异性抗原30min,鼠抗SMC-α-actin(1:200PBS稀释)室温下孵育细胞2h,PBS缓冲液洗涤3次,5min/次。以下步骤避光:用荧光标记二抗(1:200PBS稀释)在室温下孵育细胞1h,PBS缓冲液洗涤3次,5min/次,然后用荧光封片剂封片后在荧光显微镜下检测(440/510nm,Ex/Em)。4结果细胞于第2天游离出,第3天沿细胞团成放射状生长,成梭形,传代后细胞生长较快,成典型的峰谷样生长,细胞形态多呈宽

8、大的长梭形,核大一只小鼠的主动脉用该法培养,10天左右即可获得106个细胞,传代生长快,可满足任何细胞试验要求。流式细胞仪检测细胞纯度达98%以上,免疫荧光检测显示细胞SMC-α-actin染色呈阳性,绿色荧光呈束状,显示肌丝特征。5讨论传统的原代培养方法[1,2]有两种,一种是酶消化法,将组织用合适的酶消化后培养,因除去了妨碍细胞生长的间质,所以产量高,但因步骤繁琐,易发生污染且材料

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