小鼠胚胎体外培养方法的改良

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1、AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI硕士学位（毕业）论文小鼠胚胎体外培养方法的改良学位申请人：孙芳园指导教师：李相运教授学科专业：动物遗传育种与繁殖学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二•一五年五月三十日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河jb农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文

2、中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：%)£1签字日期：年<月

3、日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字曰期：及_6月I曰签字曰期�7oOr年《月曰学位论文作者毕业后去向:电邮is:氣工作单位:通讯地址:

4、分类号：S813.7单位代码：10086密级：公开学号：2012332小鼠胚胎体外培养方法的改良Improvementofthemethodforinvitrocultureofmouseembryos学位申请人：孙芳园指导教师：李相运教授学科专业：动物遗传育种与繁殖学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年五月三十日河北省自然科学基金项目资助(批准号:C2012204047)SupportedbyNaturalScienceFoundationofHebeiProvince(No.C2012204047)摘要尽

5、管早期胚胎体外操作有一定的研究进展，然而体外培养的胚胎质量仍然较低，其着床与妊娠率仍然低于体内正常发育的胚胎，我们建立一种动态的微环境胚胎培养系统将模拟胚胎体内发育的纤毛摆动与输卵管收缩的机械刺激与微小的生化环境以改进胚胎培养系统以进一步提高胚胎质量与发育潜能。采用内径0.21mm、外径0.28mm的塑料毛细管培养胚胎，将吸有胚胎的毛细管浸在盛有蒸馏水的烧杯内，再将烧杯放置在培养箱里的磁力搅拌器上，允许胚胎在微小的空间内发育并伴随着水的旋转而摆动，更好地模拟了胚胎在输卵管中的运动环境。通过大量实验数据验证表明毛细管规格为34G，磁

6、力搅拌器的转速为180r/min时，效果最佳。1)分别对85枚、82枚2-细胞胚胎进行毛细管及微滴培养，其中毛细管培养胚胎的囊胚率以及胚胎细胞数（85.4%，57.0）显著高于微滴培养（36.5%，20.6），囊胚率差异显著(P＜0.05)。且接种在Matrigel基底膜上形成的内细胞团集落显著增大;2)毛细管培养的胚胎，将1-细胞胚胎、2-细胞胚胎用毛细管培养法培养至囊胚阶段（E3.5d）用非手术法移植到3.5d的假孕鼠体内，正常体内发育的胚胎（E3.5d）取出后，用非手术法移植到3.5d的假孕鼠体内。10.5d后剖腹产，结果表

7、明毛细管培养的胚胎与体内正常发育的胚胎同期发育，差异不显著（P>0.05）；3)嵌合体的制备，采用无GFP标记的恒河猴胚胎内细胞团样干细胞，注射到毛细管培养与微滴培养获得的8-细胞/囊胚中，胚胎移植到2.5d的假孕鼠体内，E13–E14d后进行小鼠全胚免疫荧光检测，发现毛细管培养的嵌合率（37/83）要明显高于微滴培养的胚胎（28/79），嵌合比例差异显著(P＜0.05)；此外采用有GFP标记的恒河猴胚胎内细胞团样干细胞，注射到二细胞内，并对其进行毛细管培养，培养至八细胞期/囊胚期（E3.5d），在荧光显微镜下观察，结果表明，毛细

8、管培养支持胚胎嵌合。小鼠胚胎体外培养方法的改良——毛细管培养，促进小鼠植入前胚胎的体外发育。优于传统的微滴培养方法。且毛细管培养法符合实验动物伦理原则。重要的是该方法为生物医药研究及人类而辅助生殖等领域的胚胎体外培养提供了研究模型。关键词：胚胎；微环境；机械振动；嵌合体；体外培养；小鼠ImprovementofthemethodforinvitrocultureofmouseembryosPostgraduate:FangyuanSunMajor：AnimalGenetics,BreedingandReproductionDire

9、ction:EmbryoEngineeringSupervisor:XiangyunLiAbstractDespiteadvancesinvitromanipulationofpreimplantationembryos,thereisstilla