不同胚龄昆明小鼠胚胎获取胚胎干细胞体外培养的比较

《不同胚龄昆明小鼠胚胎获取胚胎干细胞体外培养的比较》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、不同胚龄昆明小鼠胚胎获取胚胎干细胞体外培养的比较【关键词】昆明小鼠;胚胎干细胞;胚龄　胚胎干细胞(embryonicstemcells,ES细胞)是从早期胚胎内细胞团(innercellmass,ICM)或原始生殖细胞(primordialgermcells,PGCs)分离出来的能在体外长久培养的、具有多向分化潜能和种系嵌合能力的细胞系。ES细胞的用途很广，涉及医学和生物工程的许多领域。　　1981年，EVANS[1]和MARTIN[2]首次成功分离得到小鼠ES细胞。目前实验中常用的小鼠ES细胞系绝大多数来自129品系，但129品系小鼠易感染多种疾病，具高频自发畸胎瘤，因此该品系小鼠不

2、宜用于免疫学和细胞、组织移植等研究[3]。　　昆明小鼠是一种国产远交系小鼠，其基因型与人类近似，建立昆明小鼠的ES细胞系有利于其转基因动物的获得，能够更好服务于我国的科研工作。目前虽有关于昆明小鼠ES细胞的一些研究，但对于何时收集胚胎尚未有明确报道。本实验旨在研究胚龄对分离培养昆明小鼠ES细胞的影响。　　1材料与方法　　1.1实验动物选取8周龄昆明品系雄性小鼠21只;周龄为7～8周、体重为30g的雌性小鼠20只，用于分离培养鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblasts,MEF);周龄为4周、体重为24～26g的雌性小鼠55只，用于分离培养ES细胞。实验动物由辽宁

3、医学院实验动物中心提供[动物质量合格证号：SYXK(辽)20030011]。　　1.2主要试剂与仪器LDMEM培养基(Gibco公司，批号1459071);HDMEM培养基(Sigma公司，批号055k8311);胎牛血清(中国医学科学院生物工程研究所，批号AB3101C091);丝裂霉素C(浙江海正，批号050912);白血病抑制因子(leukaemiainhibitoryfactor,LIF)(Sigma公司，批号064K1083);NBTBCIP染色试剂盒(华美公司，批号NBS206006);CO2培养箱(美国SIM公司，E191TC);倒置显微镜(日本Olympus

4、公司，CKX41)。　　1.3实验方法　　1.3.1MEF的分离培养及饲养层的制备雌雄鼠合笼，每天早上观察阴道栓，见栓当天上午定为怀孕的第0.5天(dayspostcoitum,dpc);取孕12.5～14.5d母鼠，断颈处死，无菌条件下取出胎鼠，去除头部、尾部、内脏和四肢，用无菌眼科剪将躯干部剪成1mm3以下的碎块，用滤网过滤细胞法[4]分离培养MEF，并制备MEF饲养单层。　　1.3.2胚胎的收集与培养分别取孕3.5、4.5d母鼠，断颈处死，无菌条件下取出子宫;用1mL无菌注射器吸入冲胚液，从子宫角端进针，保证针头进入子宫腔内，将冲胚液快速推入子宫腔;每侧子宫注入冲胚液0.2～0.

5、5mL，冲胚液会将胚胎冲出;将盛有胚胎和冲胚液的平皿置于40～100倍的倒置显微镜下;用移液器(上海大龙公司，0.2～10μL，YR23777)收集胚胎;以文献[5]所示方法进行培养。　　1.5统计学分析用SPSS11.5软件对实验所得数据采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1不同胚龄胚胎的生物学特征本实验共收集3.5dpc昆明小鼠胚胎91枚，4.5dpc昆明小鼠胚胎69枚，3.5dpc昆明小鼠胚胎多为桑椹胚(图1)，周围有透明带包绕;4.5dpc昆明小鼠胚胎多为囊胚(图2)，囊腔明显，滋养层被囊腔推到一侧，有些形成ICM。胚胎AKP检测强阳性(图3)。

6、培养的ES细胞克隆，克隆内细胞界限不清楚，边缘清楚(图4)。　　2.2不同胚龄胚胎体外培养情况的比较囊胚胚胎的贴壁率、ICM形成率、ES细胞克隆率(P1)形成率和ES细胞亚克隆率(P2)形成率明显高于桑葚胚，两者比较均有显著性差异(P<0.05，表1～表3)。表13.5dpc胚胎体外培养生长情况表24.5dpc胚胎体外培养生长情况表33.5dpc胚胎和4.5dpc胚胎体外培养生长情况的比较　　3讨论　　小鼠ES细胞的体外分离培养是一项复杂的工作，受多种因素的影响，选择恰当的时间来收集胚胎以分离胚胎细胞，对以后ES细胞的分离培养是一个极重要的影响因素。因此，在进行小鼠ES细胞研究中

7、，胚龄至关重要。为了进行ES细胞的培养，收集胚胎的时间必须在胚胎着床以前，同时也需要胚胎在体内有一定的发育，以使胚胎更好适应体外培养环境，实验中多选孕3.5～4.5d来收集胚胎。EISTTER[6]采用培养小鼠桑椹胚单个卵裂球建成ES细胞系，其成功率比用囊胚要高的多，可能由于桑椹胚处于比囊胚更早的发育阶段，有更多的细胞保持发育的全能性，而且他采用的是桑椹胚单个卵裂球，去除了滋养层的分化诱导作用，因此ES细胞建系成功率高。形成率4.5dpc胚胎显