昆明种小鼠胚胎干细胞的培养及鉴定

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1、昆明种小鼠胚胎干细胞的培养及鉴定【关键词】小鼠胚胎干细胞ES细胞系Abstract：ObjectiveToisolateandcultureembryonicstem(ES)cellsfromKunmingspeciesmouse.MethodsTheblastocystsof3.5dfromKunmingspeciesmouseinnercellmass(ICM)cellsorphologicalcharacteristicssuchasnest-likecolonies,roundorell

2、iptic,oothsurface,strongrefraction,significants.AftertheAKPstaining,alloftheEScellsshobryonicfibroblastcellshadnoexpressionofAKPshobryonicstemcellscanbeisolatedandculturedfromKunmingspeciesmouse.Keyingspeciesmouse;embryonicstemcells胚胎干细胞(EmbryonicSte

3、mCell，ES)是一种多能的未分化细胞，是从早期胚胎的内细胞团(innercellmass，ICM)中分离出的多能干细胞。由于它可以参与胚胎发育，将所携带的基因导入受体，生成嵌合体，因此ES细胞已成为制作转基因动物的主要途径之一。也可以利用ES细胞模拟早期胚胎细胞的发育过程，分析参与早期发育中细胞分化与决定的因素，研究基因的调控，建立疾病的动物模型，利用ES细胞还可以为临床提供器官移植、修复器官或组织的原材料［1，2］。最近，基因打靶及基因捕获又成为应用胚胎干细胞进行研究的热点［3］。小鼠的E

4、S细胞分离培养最早是在1981年由英国Evans和Kaufman［4］完成的，以后又有陆续建立了数百个小鼠ES细胞系［5-7］。但这些小鼠细胞系多于129，C57BL/6J等品系，而国内应用最广泛的昆明种小鼠ES的建系率很低。本实验尝试建立昆明种ES细胞系，为进一步的研究工作提供条件。1材料和方法1.1动物来自辽宁医学院实验动物中心，昆明种小鼠，6～8周龄，体重25～35g。1.2试剂丝裂霉素C（MitomycinC，Sigma，M-4287），MEM培养基（GIBCO公司），胎牛血清（GIBC

5、O公司），白血病抑制因子（LIF，CHEMICON公司），孕马血清绒毛膜促性腺激素（PMSG，杭州动物药品厂），人绒毛膜促性腺激素（HCG，杭州动物药品厂），碱性磷酸酶（AKP，南京建成生物制品研究所）1.3细胞培养1.3.1饲养层细胞的制备无菌条件下取孕13～16d的小鼠胚胎，去头，去尾，去胸腹腔脏器及四肢，用眼科剪剪成乳糜状，胰酶消化，机械吹打后种植于25mL玻璃培养瓶中，加入含10%小牛血清(杭州四季青公司)、2×10-4mol/L谷氨酰胺、10μg/mLLIF、50U/mL青霉素的MEM

6、培养基(Gibco公司)。于37℃，5%CO2培养箱中培养24h，更换培养基后培养72～96h至细胞融合，常规传代。将融合的鼠胚成纤维细胞加入含20μg/mL丝裂霉素－C的上述培养基中培养2～3h后，常规胰酶消化，单细胞悬液按密度1×106/mL种植于6孔板中，细胞贴壁伸展后(约3h)，饲养层细胞制备完毕。高巍，等：昆明种小鼠胚胎干细胞的培养及鉴定辽宁医学院学报2008年2月，29(1)1.3.2囊胚的获得用PMSG和hCG促进雌鼠超排卵，48h后雌雄合笼，阴栓检出日记为受孕0.5d。孕3.5d

7、时无菌取出小鼠子宫，用含冲胚液（MEM＋20%FBS）的注射器冲洗宫腔，在解剖显微镜下收集囊胚移入已制备好的饲养层中。1.3.3囊胚的培养囊胚于饲养层细胞上进行培养，48～72h后透明带自行脱落。将裸胚置于饲养层细胞上培养，使用ES细胞培养液。1.3.4ICM的分离72h后去滋养层较彻底的裸胚已有ICM孵出并长大，3～5d后ICM已长大2.5倍。在解剖显微镜下，用自制的口吸管连接140μm的玻璃微针小心挑起ICM，使之与饲养层以及滋养层细胞分离，并吸至消化液小滴内（0.25%胰蛋白酶～0.04%

8、EDTA混合消化液），使ICM在消化液小滴内作用1～2min，并用内径为70μm的玻璃微针轻轻吹吸ICM，使之分散成若干个由细胞组成的小团块，这时可继续将ICM消化成单细胞，再分别移入新的饲养层细胞上继续培养。1.3.5碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，AKP)染色鉴定小鼠胚胎干细胞。2.2ES细胞的分离培养共收集57枚昆明种小鼠胚胎，其中囊胚39枚，桑椹胚18枚，其中共有31枚(54.6%)的ICM增殖到能够离散的程度（图1）。ICM离散后有4例出现了ES细胞样集落(12.9