鸡胚胎干细胞的分离、培养及鉴定

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1、鸡胚胎干细胞的分离、培养及鉴定【中文】目前，世界各国争相研究胚胎干细胞并已取得了很大的进展，但是迄今为止仅在小鼠上获得真正意义上的ES细胞，即具有参与生殖系传递能力的ES细胞。本课题的目的是探索影响鸡ES细胞生长的各种因素，从而建立适于鸡ES细胞生长的培养体系并最终获得鸡ES细胞。本实验采用饲养层培养法，以高糖DMEM添加β—巯基乙醇、胎牛血清、各种生长因子等为培养基，鸡的x期胚盘为实验材料，分离筛选鸡ES细胞，并利用形态学鉴定、AKP染色、体外分化实验、嵌合体的制作等方法对所获得的细胞克隆进行鉴定。鸡ES细胞的生长受多种因素的作用，其中饲养层是影响鸡

2、ES细胞生长的关键因素之一。经反复实验对比鸡胚原代成纤维细胞饲养层、小鼠胚胎原代成纤维细胞饲养层、SNL细胞饲养层等三种不同饲养层的作用效果，最终发现以小鼠原代成纤维细胞制作饲养层所获得的鸡ES细胞阳性克隆率最高，在传代过程中ES细胞的细胞成活率也明显高于其它两种饲养层细胞。各种生长因子的添加也影响着鸡ES细胞的生长。LIF、SCF、bFGF等生长因子对ES细胞的增殖生长具有不同的作用，其中SCF、bFGF均不同程度的对ES细胞的生长有促进作用，但在无LIF因子存在的条件下ES细胞分化的现象比较明显。如加大LIF因子的添加量(2000IU／ml)，即使

3、在无饲养层的条件下ES细胞也会维持不分化现象。并且发现LIF、SCF、bFGF三种生长因子按一定比例同时添加时ES细胞的AKP阳性克隆率最高，与单独添加某一种生长因子的效果差异极显著。在鸡的x期胚盘细胞原代培养过程中，消化液可促进细胞的离散但细胞培养效果不如只用机械吹打的力量将胚盘分散，若克隆一旦形成，在传代过程中则需要消化液的作用并借助微针的剥离作用将克隆分散为小克隆或单细胞悬液(本实验所用的消化液为0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA)。同时发现如将胚盘细胞明、暗区分开分别培养，结果由明区分离培养得到的ES细胞阳性克隆率明显高于暗区及明+暗区，且

4、克隆表面所附着的卵黄颗粒也比较少。将明暗区的胚盘细胞混合培养时所获得的ES细胞阳性克隆率界于单独使用明、暗区之间。鸡x期胚盘细胞在饲养层上培养24h之后即会出现克隆，48h后克隆较明显，多呈圆形，其上附有卵黄颗粒(镜下呈黑色颗粒)，细胞间的间隙不明显。3～4天后克隆生长明显，隆起增大，多呈鸟巢状，还有山包状，葵花状等。若细胞生长密集时两个克隆或更多个克隆连在一起呈多种型状。5～6天后克隆进一步生长增大，边缘更加清晰但同时也伴有少量的细胞分化，此时便需传代。离散后的细胞置于新的饲养层上24h后即可部分重新聚集增殖，但性状并不典型，48～72h后会有集落出

5、现，之后慢慢增大。将传至3、4代的鸡ES细胞用三种冷冻方法分别进行冻存，一个月后快速解冻，以鸡ES细胞的克隆数为细胞复苏存活标准，发现用冷冻程序1进行的慢速冷冻方法冷冻效果最好。山东农业大学硕士研究生论文（2002）分离得到的鸡ES细胞经AKP染色后呈深蓝紫色，而饲养层细胞不着色。在体外分化实验中，鸡ES细胞在无饲养层无LIF因子的培养液中培养时l～2天即可出现分化现象，3～4天可观察到几种细胞类型。最后用传至3代、4代的ES细胞集落离散后制作嵌合体，得到了3只毛色嵌合体鸡。以上结果表明用PMEF细胞饲养层，高糖DMEM为基础培养基，其中按一定比例添加

6、各种生长因子及FBS等物质可将鸡胚盘细胞在体外进行长期培养，虽然还没有获得鸡ES细胞系，但本实验所获得的细胞具有ES细胞的诸多特性，如果继续进行筛选、优化，必将能获得鸡ES细胞系。