牛胚胎干细胞（bESCs）的分离培养与初步鉴定

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1、◇中山大学硕士学位论文摘要牛胚胎干细胞(bESts)的分离培养与初步鉴定专业名称：动物学硕士研究生：徐绍坤指导导师：郭中敏副教授中文摘要目前国内外有关牛ES细胞的培养己取得了相关进展，己分别从体外受精胚胎、胎牛原始生殖嵴、牛鲜胚内细胞团以及核移植胚胎中初步分离获得了牛类ES细胞，但均未建立可稳定传代的ES细胞系，真正意义上的牛ES细胞尚没有成功建立，但已有报道从牛内细胞团细胞体外培养出了类ES细胞并能分化成各种细胞。本研究旨在分别通过从冷冻胚胎以及鲜胚中尝试分离培养牛类ES细胞，比较两种来源的胚胎的ES细胞克隆形成率及各自优缺

2、点，尝试从致密桑椹胚中提取卵裂球细胞进行ES细胞的克隆培养，并通过有无饲养层两种不同培养方法，观察饲养层细胞与LIF对牛类ES细胞生长的影响，探索出适宜牛类ES细胞的培养体系，为下一步培养建立牛Es细胞系提供实验研究基础。通过研究，我们得出以下结论：(1)通过对30天左右的羊胚胎进行胚胎成纤维细胞培养，证实羊胚胎成纤维细胞增殖较为旺盛，经丝裂霉素C处理后，适宜牛胚胎的快速贴附生长。而牛骨髓间充质干细胞经处理后，正常细胞状态维持时间短，不适宜制作饲养层。(2)通过全胚培养，从冷冻胚胎与鲜胚均得到了明显的ES细胞克隆，冷冻胚胎组最

3、高可传5代，鲜胚组传至7代因真菌污染丢失。本实验中所培养的牛类ES细胞具有三个特性：核质比高，多核仁，细胞质中有较多的小囊泡。ES细胞克隆的形态是细胞紧密聚集，界限不清，边缘光滑，克隆表面折光性颗粒多，圆形或椭圆形，形似鸟巢，集落与饲养层界限分明，色泽较小鼠ES细胞集落深亮。(3)冷冻胚胎的胚胎孵化率，内细胞团形成率以及类ES细胞克隆形成率均低◇中山大学硕士学位论文摘要于鲜胚。可能是由于胚胎经过长期冷冻保存之后，活力下降，某些相关成份缺失，发育分化中的部分基因表达处于休眠状态或缺失，致使其发育不良。(4)所获得的牛类ES细胞具

4、有多向分化潜能，在撤去抑制因素条件下可自然分化成上皮样和成纤维样细胞，悬浮条件下可形成拟胚体。另外发现牛类ES细胞依赖于紧密的贴附于饲养层细胞上来维持自身的未分化高增殖活性，单独应用LIF在无饲养层条件下培养，类ES细胞出现部分自然分化现象，同时细胞增殖减慢，一般传代不超过3代，类ES细胞丢失。(5)未分化的牛类ES细胞AKP活性呈阳性，染色体核型分析显示鲜胚组第5代类ES细胞为近2倍体核型，核型正常。(6)尝试从致密桑椹胚中提取卵裂球细胞进行ES细胞的克隆培养，所获得的类ES细胞晟高传至3代，细胞多分化凋亡，克隆形成率低，而

5、囊胚阶段的胚胎的克隆形成率高，更适合于ES细胞的分离培养。(7)季节变化所带来的温差效应对胚胎的正常发育和ES细胞克隆的分离有着一定的影响，因此奶牛超数排卵适宜选择于春秋两季进行。关键词：牛；ES细胞；超数排卵；羊胚胎成纤维细胞Isolatedcultureandinitialidentificationofbovineembryonicstemcells(bESCs)Major：zoologyMasterCandidate：XuShao．kunSupervisor：AssociateProf．GuoZhongminABSTR

6、ACTTheresearchofisolationandcultureofbovineembryonicstemcellshasachievedmoreprogress．Sofar,bovineES．1ikecellsweresuccessfullyderivedfrom／nvitrofertilization(IVF)embryo，fetusprimitivegenitalridge，innercellmass(ICMloffreshembryo，andnucleartransferfNT)embryo．However,al

7、lofthosecellscannotbestablelypassaged，thusthereallybovineEScellswerenotsuccessfullygeneratedandcultured，eventhoughsomeresearchreportedES—likecellswerederivedf}omICMandtheseCalldifferentiateintoallkindsofcells．ThepresentresearchaimsatisolatingandculturingbovineES-lik

8、ecellsfromfrozenandfreshembryo，andcomparingthecloningefficiencyandthequalityofEScellsandthedisadvantagefromthetwodifferentsourcesofembryo．