牛胚胎干细胞分离克隆的研究

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1、牛胚胎干细胞分离克隆的研究【摘要】「【的从牛原始生殖细胞屮分离克隆牛胚胎干细胞。方法采川与同源胎儿成纤维细胞共同培养的方法，以高糖DMEM添加0.1mM2■筑基乙醇、犊牛血清为培养基，以4〜13周龄牛胎儿为实验材料，从牛原始生殖细胞中分离克隆牛胚胎干细胞。结果参与胚胎干细胞分离克隆的40例牛胎儿中，一•体长6.5cm的雌性胎儿胚胎干细胞传到15代；分离得到的牛胚胎干细胞，经碱性磷酸酶染色，体外分化实验，核型分析证明其具有胚胎T细胞的诸多特性。结论可以从4〜13周龄牛胎儿的原始生殖细胞中分离克隆胚胎T细胞。【关键词】牛胚胎T细胞；分离克隆；原始生殖细胞基金项目：国家

2、白然科学棊金(C010902)及国家”九五”重点攻关课题资助项目。IsolationandCloningofBovineEmbryonicStemCellsLISong,MiaoZeng-min,SONGWen-gang,GAOPei-an,JIANGXin-quan,DOUZhong-yingTaishanMedicalCollege,Taian271000,ChinaAbstract:Objective:Toisolateandclonebovineembryonicstemcellsfrombovinefetus’Primordialgermce

3、lls(PGCs).Methods:ThebovineEScellsfrom4-13weeksoldfetuswerecoculturedwithhomologousfetusfibroblast.TheculturesystemwascomposedofDMEM(highglucose)supplementedwithNBS,o」mMbeta-mercaptoethanol.Results:Thenumberofbovinefetuscollectedfromslaughterhousewas50.Inthesefetus,10oneswerecontamina

4、tedduringmanipulation・TheEScellsderivedfroma6.5cmlengthwerecontinuouslypassaged(passage15);.Inthisstudy,thebovineEScellscontinuedtobealkalinephosphatasepositiveandhadthecapacityofformingembryoidbodies.Furthermore,theywerefoundtobekaryotypicalIynormalandstable・Conclusion:Itisafeasiblew

5、aytoisolateandcloneEScellsfrom4-13weeksoldbovinefetus&rsqu();PGCs.Keywords:bovineembryonicstemcells;isolationandcloning;primordialgermcells自Evans和Kaufman(1981)［1］从延期着床的小鼠早期胚胎中分离得到胚胎干(ES)细胞后，早期胚胎(桑棋胚、囊胚)一直成为分离克隆ES细胞的唯一來源。直到1992年，Matsui等［2］以附植后小鼠胎儿的原始生殖细胞(PGCs)为材料，培养得到ES细胞,并首次较为全面证实了PGC

6、s同样可作为ES细胞分离克降的原材料。本实验口的就是以牛胎儿原始生殖细胞为材料，分离克隆牛ES细胞，完善以PGCs为材料分离克隆牛ES细胞的程序。1材料与方法1.1实验动物取1T西安某屠宰场4〜13周龄的新鲜牛胎儿，共用50个胎儿。1.2主要试剂高糖DMEM、胎牛血淸(FBS)购口Gibco公司、2-筑基乙醇(2ME)。1.3基础培养液DMEM+FBS+0.1mM2ME1.4牛ES细胞的分离常规获取牛原始生殖细胞［3］,并将获得的细胞与同源牛胎儿成纤维细胞共同培养。1.5牛ES细胞的克隆传代待牛ES细胞集落周I韦I开始出现少许分化迹彖即应传代，将该集落与成纤维细胞

7、饲养层一起消化离散后接种在新的培养皿中。1.6牛ES细胞的鉴定通过AKP染色、核型分析以及体外分化实验的方法鉴定所获得的细胞是否具备ES细胞的特性。2结果2.1牛ES细胞集落的牛长行为及传代后的情况牛ES细胞集落同成纤维细胞一样，在体外有一个逐渐生长的过程。培养12h时，发现有4〜5个PGCs组成的小集落，口已贴雄。培养至第7天，出现典型鸟巢状ES细胞集落。此外,还有山包状、馒头状和葵花状等多种形态。集落出现吋间与Chemy等报道的相似。实验观察到牛ES细胞集落的形成是PGCs增殖和细胞间相互聚集的结果，同吋ES细胞集落Z间也发生聚集现象。牛ES细胞集落离散后，在

8、24h内，