牛胚胎干细胞建系因素的研究

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1、中山大学硕士学位论文牛胚胎干细胞建系因素的研究曹善柏牛胚胎千细胞建系因素的研究专业：细胞生物学硕士生：曹善柏导师：刘林教授摘要胚胎干细胞具有潜在多能性和无限增殖能力，可在体内或体外定向诱导分化为各种组织。建立牛胚胎干细胞系在组织工程、再生医学、细胞及基因治疗等基础研究、生产实践和临床治疗方面将有着广阔的应用前景。然而，在过去25年的时间里，分离和建立牛胚胎干细胞系却遇到了很大挑战．尽管有很多关于牛ES细胞的报道，但它们在细胞形态、多能性标记等方面很大不同，且不具备真正的体内和体外发育多能性，目前尚未有真正意义上的牛胚胎干细胞系的建立．为了进一步阐明牛ES细胞多

2、能性的维持机理，建立真正的、稳定的牛ES细胞系，本论文对牛原代ES细胞的分离、鉴定以及培养条件进行了系统探讨．首先，我们从牛囊胚中成功分离得到具有典型ES细胞形态学特征并特异性表达AP、SSEAl、SSEA4、Oct4和Nanog等多能性标记的牛原代ES细胞。并且发现Nanog蛋白在牛ES细胞、牛囊胚滋养外胚层和内细胞团的细胞质都有表达，与其他物种仅在内细胞团和Es细胞的细胞核表达的情况有明显差异。通过对不同来源的胚胎、饲养层细胞和血清等影响因素进行比较。发现采用体内发育的囊胚为胚胎来源、以小鼠成纤维细胞为饲养层、在20％的KSR条件下有利于分离获得原代牛Es

3、细胞。而在随后的培养传代过程中发现，38．6℃、5．6％cO。的培养条件以及含20％FBS和4ng／mlbFGF的培养液更有利于牛Es细胞的自我更新及增殖。但这些改进的分离方法和培养体系仅能维持牛Es细胞未分化的状态到3～4代。此外，hLIF、ERK抑制剂PD98059、神经营养因子(BI)NT和ST4)以及黄嘌呤(Xs)不但未起到它们在其他物种来源的干细胞中维持自我更新及多能性中【lJ大学硕士学倚论文牛胚胎T细胞建系圜袈的研究曾营柏的作用，反而促使牛Es细胞分化。有研究表明，氧化应激能够导致细胞衰老并影响干细胞多能性。我们猜想抗氧化物是否能进一步维持牛Es细

4、胞未分化的状态。然而，额外添加抗氧化剂却无法进一步保护Es细胞。综上，我们不仅成功分离得到具有典型形态特征的牛原代Es细胞，而且为牛ES细胞的分子鉴定提供了依据。更重要的是Nanog在牛Es细胞及牛囊胚的特殊表达模式和维持多能性所需的不同生长因子，表明牛Es细胞在维持多能性的分子机制方面明显不同于人或小鼠的Es细胞，这可能是牛Es细胞系难以建立的主要原因。我们的数据为进一步阐明牛ES细胞多能性的维持机理，优化牛Es细胞培养体系，最终建立牛Es细胞系提供了重要的参考依据。关键词：牛，囊胚，胚胎干细胞，多能性中山大学硕士学位论文牛胚胎千细胞建系因素的研究曹善柏St

5、udiesonIsolationofBovineEmbryonicStemCellsMajor．CellBiologyName：CaoShanboSupervisor：．Prof．LinLiuEmbryonicstem但S)cellsproliferateindefinitelyinculturewhilemaintahangphnipotency．EstablishmentofbovineEScellshasgreatimplicationsina掣训nⅡ吐pharmaceuticalandbiomedicalapplications．Yet,ithasbe

6、enaUemendonschallengetoderiveandestablishbovineEScells,klsed013studiesauangthepasttwodecades．Althoughbovine”ES—tikelitcelllineshavebeenreported,蛾ofthesecelllineshavebeendefinitivelyproventobeanthentie醪cells．Theyvariedsignificantlynotonlyinmorphologyandmolecularmarkers,butalsoinchrom

7、osomalstabilityandpluripoteney．TounderstandthemechanismlmdedyingsustainingbovineEScellpluripotency,and幻establishbovineEScelllines,WesystematicallyperformedexperimentsonisolationofbovineES∞lIs'andoptimizedconditionsforcultureoftheEScells．1ira,WOisolatedbovineprimaryEScellsfrombtastoc

8、ysts,whichexhibited