猪胚胎干细胞（eg）建系影响因素的研究

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1、中文摘要1．本实验以中国近交系五指山小型猪(WZSP)和微型白猪为材料，先后从27头猪采集了312枚早期胎儿用于进行猪胚胎干细胞(EG)建系影响因素研究，得出如下结论：(1)d26．28猪胎儿可用于制作胎儿成纤维细胞。制作饲养层时，STO、MEF。细胞J=

2、j10u∥mL丝裂酶素C处理1．75h～2h：PEF细胞用丝裂酶素c处理2．25h-25h。(2)分别收集d27WZSP和微型白猪胎儿，实验结果证明，WZSP和微型白猪在EG细胞培养方面没有显著性差异(P>O．05)，都可以用来作为EG细胞建系的

3、材料。(3)分别采集d26、d27、d28胎儿，在相同条件下培养，实验结果证明，d26、d27、d28胎儿PGC细胞培养效果差异不显著(P>0．05)。(4)采集d27胚胎，分别放在两种培养液中培养『培养液l：DMEM(丙酮酸钠)+15％FCS+l％L一谷氨酰胺+I％MEM一非必需氨基酸+1％Penicillin—Streptomycin十10p．M13·琉基乙醇：培养液2：DMEM(丙酮酸钠)：HFl0(v：v=50：50)+15％FCS+1％L．谷氨酰胺十I％MEM．非必需氨基酸+1％Penic

4、illin—Streptomycin+IO“MB．巯基乙醇+1000IU／mLLIF+40ng／mLSCF+20ng／mLbFGF]，结果证明两种培养液培养PGC细胞效果差异不显著(P>O．05)。(5)用不同饲养层培养PGC，实验结果证明PGC在新鲜制作的STO和MEF。饲养层上，可以得到传3代以上的EG集落；PGC在铺有解冻的sTcI饲养层细胞、PEF或丝裂霉素C处理过的PEF、涂有0．1％明胶的4孔板上，一直没有得到典型的EG集落。(6)用两种方法从生殖嵴获得PGC细胞：a，机械分离；b，化学

5、消化+机械分离。结果证明两种PGC采集方式培养效果没有显著差异(P>O．05)；比较了一个胎儿的4PGC接种r、夏3、4个培养孔(4孔板)，结果证明接种密度以1个胎儿接种2—3个培养孔的密度比较合适。(7)对非饲养层培养系统培养猪PGC进行了初步探索。实验结果证明，以STO为饲养层，培养液中加条件培养基对猪EG细胞保持不分化状态有积极作用，但培养板底铺有STO基质或明胶，即使用条件培养基也没有获得典型的EG集落。(8)以STO细胞为饲养层，培养液中加否生长因子对EG培养效果影响不大(p>o．05)，

6、但培养液中加入生长因子后，对EG细胞培养传代更有利。而培养板底只铺有O．1％的明胶时，即使培养液中加入生长因子也没有形成典型的EG集落。(9)对原代出现的EG集落分别在不同时间传代，实验结果证明，在原代出现大批EG集落的(以出现大批EG集落的当天为第1天，d1)第2(d2)、3(d3)、4(d4)天传代效果好；对原代出现的EG集落分别采用三种消化方式传代：a，消化液l(O．2％Trypsion．004％EDTA)+一次离散法；b，消化液2(含O．1％鸡血清的消化液1)+一次离散法；c，消化液2+连续

7、离散法。实验结果证明，用a、b、c三种方式传代原代EG集落后都能形成新的大量EG集落。2．将新鲜和培养24h的PGC、6代前的EG细胞进行显微注射。从42头供体猪获得564枚胚胎。419枚胚胎注射PGC／EG细胞，与未注射的145枚胚胎搭配混台后分别移植给22头受体猪。其中3头妊娠，一头(移植注射第2代EG细胞胚胎)妊娠后来终止；一头产下10头自猪仔(移植注射新鲜PGC细胞胚胎)；另一头(移植注射第6代EG细胞胚胎)产下8头猪仔，其中2头经皮肤色素和分子遗传学鉴定证明为嵌合体猪。这是我国首例获得的E

8、G细胞嵌合体猪。关键词：猪，胚胎干细胞，嵌合体IIABSTRACT1．Atotalof312fetuseswerecollectedfrom27WuZhiShaninbreedingPigs(WZSP)andWhiteMinitypePigstostudythefactorsinfluencingtheestablishmentofPorcineEmbryonicGermcells，andwedrawtilefollowingconclusions：(1)Wecangetembryonicfibro

9、blastsfromd26-28fetuses(dayoffirstmatingisday0，thatisdO)；Inthisthesis．STOandMEF。wereinactivatedbyincubationinmediumcontaining10ug／mLofmitomyeinCfor1．75h-2h；WhilePErwereinactivatedbythesamemediumfor2．25h～2．5h．(2)Fetusesatd27werecollected