猪胚胎干细胞分化实验研究

《猪胚胎干细胞分化实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、以科学发展现促进科技创新(一)91猪胚胎干细胞分化实验研究况玲1冯书堂2牟玉莲2刘岚21．新疆农业大学，新疆乌鲁木齐，830052；2．中国农科院畜牧所，北京，100094摘要猪原始生殖细艟．(porcineprimordialgermcells，PGcs)具有干细胞的显著特性，能在体外分化为神经细胞、上皮细胞和胚泡细胞。当悬浮培养时猪EG细胞形成拟胚体，再经维甲酸(RA)和=甲基亚矾(DMSO)诱导分化类桑椹胚体、类ES样细胞集落、神经样细胞和滋养层样细胞。关键词猪胚胎干细胞分化雏甲酸二甲基亚砜胚胎干细胞(

2、embryonicstemcell，ES)是一种能在体外增殖，又能保持未分化状态的细胞。在一定条件诱导下，可向多个方向分化，并生成多种功能性细胞。目前已经从胚胎干细胞分化培育出了心肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞和壁细胞、胰岛细胞等(HubnerK，FuhrmannG。ChristensonL．K．etal，2003)。EG细胞的定向分化作为种子细胞，较以往用人或动物的组织细胞作种子细胞好，数量大，生长快，取材容易。目前用实验动物ES细胞作核受体，用自身细胞作为供体，经细胞核移植分离ES细胞，经定向分化，用作克

3、隆治疗，解央异俸移植的排异问题。对胚胎于细胞的研究具有广阔的应用前景，但也存在很多问题尚待解决。一、材料(一)实验动物大白猪(中国农科院畜牧所)，胎儿来自自然发情的性成熟的母猪。(二)主要试剂DMEM粉(Dutbeeco’sModifiedEagleMedium，[GIBCO])培养液；无Ca”、Mg”PBS缓冲液；胰酶一EDTA混合液(SIGMA)，丝裂酶紊C[MitomyeineC，(SIGMA)]，胎牛血清(FCS)(GIBCO)．新生牛血清(NBS)(杭州四季青生物工程材料有限公司)，干细胞生长因子[

4、stemcellfactor，rhSCF，(R&D)]；成纤维细胞生长因子[basicfibroblastgrowthfacmr，bFGF(R&D)]，青链霉裹(G1BCO)，非必须氨基酸(GIBCO)，p一巯基乙醇，L一谷氨酰胺(GIBCO)，0．1％明胶，维甲酸[Retinolcacid，RA，(SIGMA)]，二甲基亚砜(Dimethylsulphoxide，DMSO)。消化液：0．25％Trypsin一0．1％EDTA。无Ca”、M92+PBS液：NaCLlOg，Na2HPOs1．449，KCL0．2

5、59，KH2P030．259，加18．20纯净水到1000mL。诱导分化培养液：A液：5×106RA的EG培养液，B液：5×106RA+0．5‰DMSO的EG培养液，C液：05％DMSO的EG培养液。92．竺竺兰兰垦兰堡兰竺兰竺兰!±!!一：==E============={；4％===；=；====；===222；522；#2j=222；；_————————————————一一二、方法(一)胚胎的收集妊娠第26．5～29d宰杀母猪，从子宫中取胚胎。将所得胚胎用无Ca”、M92+PBS冲洗几次，从胚胎中分离生

6、殖嵴，用无ca2+、M92+PBS反复冲洗几遍。将生殖嵴在玻璃表面皿上研细，用细的吸管吹打，放入离心管沉淀10min后取上清液，反复沉淀2次，然后1000r]min离心lOmin，将沉淀细胞加胚胎干细胞培养基接种在新鲜的滋养层上，原始生殖细胞(primordialgermcells，PGCs)在38．5℃，5％C02培养箱中培养。(z-)EG细胞的培养将收集的PGCs细胞分别接种于前一天制作的新鲜的STO细胞饲养层上培养，第二天观察，换掉1／3的培养液继续培养。PGCs在培养的第二天就开始有EG细胞积聚出现，

7、到第三天和第四天开始出现大量的细胞聚集，并开始大量的有EG细胞集落出现，到第七天和第八天EG细胞集落出现达到高峰，这时可以传代培养，每天需换液一次。(三)拟胚体的制备将猪胚胎生殖细胞(embryonicgermceil，EG)I书EG细胞培养液悬浮或在只涂有明胶的培养皿中培养，培养3～4d拟胚体形成。(四)拟胚体的诱导分化当出现拟胚体(EB)时，将拟胚体分为4组，移人涂有明胶的培养皿中，分别用A诱导液，B诱导液和C诱导液进行培养。第四组为对照组。每天观察2次，3～4d拟胚体贴壁生长并开始出现分化。三、结果猪E

8、G细胞以悬滴培养或在明胶铺底的96孔培养皿中培养4～5d，形成拟胚体(图1)，通过培养共收集到47个拟胚体。分为四组用不同的诱导剂做分化实验，A组10个使用诱导剂A液，B组11个使用B液，C组14个使用C液，D组12个为对照组。培养三天后，拟胚体扩大出现胚胎状。第四天后拟胚体逐渐开始出现贴壁，A组拟胚体贴壁生长，滋养层样细胞(图2)展开生长；B组5个分化发育为类桑椹胚状(图3)，2个分化为神经样细胞