人胚胎早期发育与人胚胎干细胞建系的初步的研究

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1、南京医科大学硕士学位论文人胚胎早期发育及人胚胎干细胞建系的初步研究摘要本实验从未经促性腺激素刺激的多囊卵巢综合征(PCOS)患者的卵巢皮质层小卵泡穿刺获得未成熟卵，并对其体外成熟、受精和早期胚胎发育进行了初步研究。结果显示，在相同的体外成熟培养条件下，与经激素刺激的未成熟卵相比，未经刺激的未成熟卵体外成熟率(71．88％)、受精率(60．87％)、卵裂率(82．14％)和受精后第三天的优质胚胎率(6．52％)均较低，其中正常受精率和优质胚胎率有显著性差异(P值分别为o．023和o．000)。未经刺激的未成熟卵受精后胚胎发育分别停滞于早期胚胎发育的各个时期，特别是

2、2～8细胞期，最终只有极少部分能发育至桑葚胚和囊胚(分别为10．87％和6．52％)。结果提示，取卵前是否经过促性腺激素刺激对人未成熟卵的核成熟无显著影响，未经刺激的未成熟卵经过体外成熟培养，可以重新启动第一次减数分裂，完成核成熟，并休止于M—II期。但是，未经刺激的未成熟卵成熟后的受精率和胚胎发育能力低，细胞质的成熟问题可能是造成这一现象的主要原因。另外，本研究的IVMM做为一种单一的培养液，不能完全模拟生理条件下卵母细胞发育的各个阶段所处的环境。应该根椐培养前卵母细胞的成熟度和其卵泡的发育状态选用不同成分的培养液分阶段成熟培养，以利于卵母细胞的充分成熟。为了

3、寻找能预示卵母细胞受精和胚胎发育能力的形态标记，ICSI前依据第一极体和卵周隙的形态以及细胞质有无内容物，对卵母细胞进行分组，比较各组问的受精率和卵裂率以及移植当天的优质胚胎率。研究发现，不同极体和卵周隙形态的卵母细胞ICSI后受精率有显著差异(P=O．044)；无细胞质内容物的卵母细胞其受精后的优质胚胎率显著高于有内容物的卵母细胞(P=O．011)。因此推测，卵母细胞的第一极体形态和卵周隙大小反映了卵母细胞的成熟度，受精前观察卵母细胞第一极体和卵周隙的形态可以预测ICSl后的受精能力。卵周隙正常，第一极体完整、形态不规则的卵母细胞成熟度最理想，ICSI后受精率

4、最高。而卵母细胞中有无细胞质内容物与其细胞质成熟度相南京医科大学硕士学位论文关，细胞质内容物可能提示卵母细胞细胞质不熟或过熟，对预测受精后早期胚胎发育的能力具有重要价值。我们对人囊胚内细胞团的分离、胚胎干细胞的培养条件和传代方法进行了初步探讨。本研究用于人ES细胞系建系的胚胎主要来源于临床IVF或ICSI周期中的废弃胚胎，其发育能力较差。实验发现，胚胎质量与原代集落的形成密切相关，囊胚形成率低、质量差，是限制建系成功的主要因素之一。我们尝试用免疫手术法和培养法分离内细胞团，实验显示免疫手术法分离内细胞团的效率优于培养分离法。将内细胞团种植于胎鼠成纤维细胞制备的饲

5、养层上，培养于含有胎牛血清、p一巯基乙醇、非必需氨基酸、谷胺酰氨、核苷酸和碱性成纤维细胞生长因子和白血病抑制因子的培养液中。该培养系统能够从形态上支持囊胚细胞增殖并维持未分化，形成原代集落，并传至2～3代。理想的传代方法和完善的体外培养系统是胚胎干细胞成功建系的两个关键因素。关键词：卵母细胞成熟，胚胎发育，卵母细胞形态，胚胎干细胞南京医科大学硕士学位论文PreliminaryStudyonHumanEarlyEmbryonicDevelopmentandEstablishmentofHumanEmbryonicStemCellLinesABSTRACTThepr

6、esentstudywasconductedtoinvestigatethein’V1t。omatura“on(IVM)ofhumanimmatureoocytesretrievedfromsmallantralfolliclesofthepatientswithpolycysticovarysyndrome(PCOS)withoutstimulating，andtheircompetenceoffertilizationandembryonicdevelopmentfollowingICSI．Wefoundthat，underthesamein-vitroma

7、turationmedium(IVMM)systermasimmatureoocytesaspirat。dtoomstimulatedovaries，thosenon-stimulatedoocytes’in。vitromaturatlonf71．88％)，fertilization(60．87％)，cleavagerates(82．14％)andpercentageof立ood-qualityembryosontheday3afterICSI(6·52％)weresignificantlylower．Thedevelopmentalcompetenceofem

8、bryosresulte