几种哺乳动物胚胎干细胞建系与初步鉴定

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1、新疆农业大学硕士学位论文几种哺乳动物胚胎干细胞建系与初步鉴定姓名：张慧申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：况玲20090401几种哺乳动物胚胎干细胞建系与初步鉴定摘要胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES)是一种将着床前胚胎的内细胞团(innercellmass，ICM)在体外培养而成的细胞，目前，仅小鼠和大鼠ES细胞系能在嵌合体中进入生殖嵴并形成生殖细胞，而其他哺乳动物，都没有建立能形成生殖细胞的ES细胞系。我们运用全新的培养体系对兔、大鼠和牛ES细胞进行建系研究，以及研究小鼠ES细胞的悬浮培养体系，建立了兔、大鼠、牛和小鼠胚

2、胎干细胞系，并经过长期培养仍保持发育的多能性。将兔、大鼠和牛的囊胚在体外机械法分离ICM，在各自的培养体系中培养，用机械法传代，将兔ES细胞培养．至lJ4代，将大鼠和牛ES细胞培养到10代和7代，均保持典型的ES细胞形态，经碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AKP)染色为阳性；R1系mES．细胞在培养液A中能够快速增殖，AKP染色呈阳性，并保持未分化状态而传20代以上，注射到nod．sciddx鼠后腿肌肉，成功长出畸胎瘤。因此得出：兔ES细胞在灭活的胎鼠内胚层细胞作饲养层，78％D．MEM／F．12+20％KnockoutSR+2m

3、M／L—Glutamine+1％MEMNAA+O．1mM／L13一mercaptoethanol+8ng／mlhrbFGF+2％CEE作培养基所构成的体系中，能很好的被分离培养，小鼠内胚层细胞和CEE联合使用能很好的支持原代兔ES细胞的生长。同样以86％DMEM+10％SR+3％CEE+1％MEMN从+2mmol／LL．Glutamine+O．tmmol／L13-mercaptoethanol为培养基，大鼠ES细胞在灭活的3T3细胞作饲养层的体系中，保持未分化状态传到10代以上；而牛ES细胞在原饲养层，保持未分化状态到7代左右。在15％FBS+100

4、0IUmLIF+0．2mg／mldispase+84％DMEM／F12+l％MEMNAA+2mmol／LL-Glutamine+0．1mmol／L[3-mercaptoethanol培养基中悬浮培养小鼠ES细胞可在体外维持不分化状态，能够快速增殖。关键词：小鼠胚胎干细胞；大鼠胚胎干细胞；兔胚胎干细胞；牛胚胎干细胞；建系；悬浮培养：AKP染色；畸胎瘤IIIDerivationandPreliminaryCharacterizationofSeveralmammalianAnimalEmbryonicStemCmammalianOlllCellllAbs

5、tractEmbryonicstem(ES)celllinesareroutinelyderivedfrominvivoproducedblastoeysts．TherehasbeenconsiderableeffortstoestablishEScelllinesfromotheranimals，SOfar,havebeenderivedfrommiceandrat．Here，weexaminedeffectsofdifferentconditionsontheestablishmentofEScellsfromrabbits，ratsandbov

6、ine．Alsotoestablishasuspensionculturesystemofmouseembryonicstemcells(ruES)．Long-termmaintenanceofEScellsintheirpluripotentundifferentiatedstateareprovidedbytheirssystem．Weisolatedtheinnercellmass(ICM)fromblastocystsofrabbit,ratandbovinemanually,thenculturedthembytheirconditions

7、．EScolonieswerepassagedmanuallytoo．Asaresult,therabbitESCs(rZS)Callbepassaged4times。ratESCs(RES)were10times，bovineESCs(bES)were7times．Meanwhile，therES，RESandbESaccordwithmorphologicalcriteriaofES．RESandbESexpressalpalinephosphatase．ESCsofthemurinecelllineR1weregrowninfeeder-fre

8、etissuecultureflasksinruESmediumA，whichconsistedof15％F