哺乳动物胚胎干细胞技术

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1、韩雪蕾哺乳动物胚胎干细胞技术主要内容一、胚胎干细胞的生物学特点二、胚胎干细胞研究的意义三、胚胎干细胞研究的历史与进展四.胚胎干细胞的分离培养基本程序五.ES细胞的保存六.ES细胞的鉴定七.ES细胞技术目前存在的问题八.ES细胞技术的发展方向干细胞功能组织发生全能干细胞多能干细胞专能干细胞胚胎干细胞组织干细胞干细胞分类全能干细胞Totipotentstemcells具有无限分化潜能的细胞。可以分化成人体的各种细胞，这些细胞构成人体的各种组织器官，如胚胎干细胞。八细胞阶段多能干细胞Multipotentstemcells具有可分化出一种器官的多种组织潜能的

2、干细胞，即能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。具有自我增殖和分化两种功能。骨髓造血干细胞就是典型的多能干细胞，移植造血干细胞治疗白血病、再生障碍性贫血等血液疾病。专能干细胞多能干细胞进一步分化成专能干细胞，只能分化成某一类型的细胞。又称单能干细胞。如表皮干细胞只能分化产生角化表皮细胞。胚胎性干细胞Embryonicstem(ES)Cells来自早期胚胎、原始生殖细胞或畸胎瘤组织等源于胚胎的干细胞，其基本特性是具有稳定地在体外自我更新、并稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能分化为属于外胚层、中胚层和内胚层范畴的各种类型分化细胞，甚至参与个体发育，

3、又称为万能细胞(Multipotentstemcells)。组织干细胞Tissue-specificstemcell指分布在成年生物体组织中负有构建和补充某种组织细胞功能的干细胞。又称为成体干细胞(Adultstemcells)。一、胚胎干细胞的生物学特点1.定义哺乳动物胚胎干细胞（EmbryoDerivedStemCells）又称ES或EK细胞，是从早期胚胎或胎儿中分离出来的具有发育全能性的细胞系。一方面具有自我更新能力，另一方面具有分化潜能。2.来源：囊胚的内细胞团（ICM）早期胚胎的种细胞或胎儿的原始生殖细胞。ICM在胚胎着床前：分化出原始内胚层

4、，紧贴着囊胚腔的内层生长，最后发育为卵黄膜；ICM在胚胎着床后：分化为原始外胚层，进一步分化为胚胎的3个种细胞层，进一步发育为胎儿。内消呼肝胰（内胚层发育为消化系统，呼吸系统，肝脏，胰脏）外表感神仙（外胚层发育为表皮，感觉，神经系）其余的是中胚层3.细胞学特点具有胚胎细胞的特性：形态上细胞体积较小，但是细胞核较大，核质比高，核仁较大，培育时呈克隆状生长，在功能上具有发育全能型，能进行人为定向分化。普通细胞系的特性：在体外培养传代而不发生分化，能进行冷冻保存和遗传改造。发育全能性：1）形成畸胎瘤：将ES细胞接种同源动物皮下可形成内、中、外三种胚层细胞。2

5、）形成类胚体：将ES细胞在非黏附底物中悬浮培养生长，或控制增殖细胞数目，形成多种系混杂的集合体ES细胞全能性体现在：3）直系分化：通过控制ES细胞生长环境或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化为某特定种系细胞。新的ES细胞建系后在体外生长时间越短，产生所有类型组织的可能性就越大。4）形成嵌合体：组织和器官的细胞含有两个或两个以上基因型构建而成的完整个体，称为基因嵌合体或嵌合体动物。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中，可形成嵌合体。ES细胞或EG细胞一旦分化即丧失全能性，难以参与胚胎发育，形成嵌合体。4.功能在滋养层细胞上或在含有分化移植因子的介质中，

6、能维持未分化状态，并实现自我更新，因此可以无限增殖；在体外，在诱导因子的作用下，可以定向分化；泌乳小鼠胚胎干细胞已经在体外诱导分化为神经元细胞、肝细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞黑色素细胞等。ES细胞具有种系传递（germlinetransmission）能力，能够形成嵌合体动物（chimericanimal）。若在体外把ES细胞注射至另一胚泡内，使之与受体胚胎细胞混合，再移植入假孕受体子宫，可发育获得嵌合体（chimeric）。ES细胞可参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。通过交配可以分离出带有ES细胞遗传性状的个体，这是ES细胞具有种系传递能力的一种证明

7、。5、ES细胞自我更新的分子机理1、LIF（白血病抑制因子）:ES细胞表面的有一复合受体，由低亲和性的LIF受体和普通亚基gp130构成异源二聚体，LIF与受体结合后激活Jak酶，通过对STAT3的磷酸化激活维持细胞自我更新的基因。（2）转录调控因子oct-4：oct-4是ES细胞维持多能性和进入分化的开关，是DNA特异结合蛋白，通过激活或者移植靶基因的转录活性，维持ES细胞的自我更新。在ES细胞中始终保持一定的水平，表达量在50~150%，才能实现自我更新和维持多能性。NiWa等（2000）研究表明：STAT3和oct-4可能作用于相同的靶基因而相互

8、协调维持ES细胞的功能。（3）通过移植酪氨酸磷酸酶SHP-2和细胞外调节激酶ERK，维持ES的