影响人囊胚形成因素的研究和人胚胎干细胞建系的初步探讨

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1、学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者躲婆迎眺泐辟㈣日学位论文版权使用授权书本人完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有

2、关数据库。作者签名：二盟导师签名：＼／{＼继生日期：矽‘年，月汨天津医科大学硕十研究生学位沦文影响人囊胚形成因素的研究与人胚胎干细胞建系的初步探讨中文摘要我国大部分生殖中心在行体外受精-胚胎移植(invitrofenilization，IvF．ET)时通常应用D3胚胎进行移植，然而囊胚移植更符合生理过程，可减少胚胎移植的数目，降低并发症的发生。为此，我们通过D3剩余废弃胚胎的序贯培养得到了一定数目的囊胚，分析了影响人囊胚形成的因素，并且利用锝到的囊胚在人胚胎肺组织成纤维细胞(humanembryonicpulmonaryfibroblasts，

3、HEPFs)饲养层上对人胚胎干细胞(humanembryordcStemcells，hEscs)建系进行了初步探讨。研究分为三部分：第一部分，影响人囊胚形成因素的研究；第二部分，饲养层的制备与处理；第三部分，人胚胎干细胞建系的初步探讨。我们将D3移植后剩余无冻存价值的胚胎采用序贯培养的方法培养到D5．7，观察囊胚形成的情况及囊胚的质量，分析了D3胚胎的细胞数和质量分级与囊胚及优质囊胚形成之间的关系，给囊胚移植提供理论支持。我们共得到98位患者D3穆植眉删余无冻存价值的203个胚胎，在患者签看知情同意书后进入本实验。将胚胎于D3转移至G2．3中，

4、每天观察胚胎发育的情况直至受精D5—7并且对囊胚进行分级。共有51个囊胚形成，囊胚形成率为25．12％，优质囊胚有14个，占所有囊胚的27．45％，全部由II+级以上胚胎形成。32位有囊胚形成的患者有16人获临床妊娠，临床妊娠率为50％，高于66位无囊胚形成患者28．79％的妊娠率(P

5、性，比如人类发育生物学和细胞治疗等。通常应用小鼠成纤维细胞(mouseembryonicnbroblasts，MEFs)作为饲养层，保证llEsCs持续生长并且维持不分化状态。如果用于人类疾病的治疗，这些细胞必须采用非动物源性培养体系以防止异源性污染，如使用人源性饲养层、条件培养基、无血清无饲养层培养体系等。我们用HEPFs作为饲养层，比较了MEFs和HEPFs的特征、传代方法等各方面的优缺点。我们将MEFs传到P3．5，P7HEPFs传到P25。结果发现，HEPFs可以使用P25以前的细胞作为饲养层，但是MEFs只能应用P5以前的细胞作饲养层

6、。另外，丝裂霉素c处理既PFs以3．25．3．5小时为宜。最后，我们对llESCs建系进行了初步探讨，目的是维持细胞系增殖并且保持不分化状态及正常核型。我们将废弃胚胎发育形成的囊胚应用“免疫刀”的方法分离得到内细胞团(innercellnlass，ICM)，种植于HEPFs饲养层上。10．14天后，进行首次传代，用机械法将原代克隆分割成约O．5衄0的小块，接种到铺有明胶的新的饲养层上，以后每5．7天传代一次。这样，我们建立了11Escs．1121，体外传17代，并且保持了正常的形态、核型和很强的碱性磷酸酶活性。关键词囊胚内细胞团小鼠胚胎成纤维细

7、胞人胚胎肺组织成纤维细胞人胚胎干细胞人胚胎干细胞系天津医科大学硕士研究生学位论文FactorsaffectinghumanblastocystfbrmationinVitroandthebasicresearchfbrestablishmentofhumanembryonicstemceHslineAbstractnaditionalIVF-ET(inViⅡDfenilization-embryo仃a11sfer)pr。cedureusual】ytramferD3embryos，but也eblastocyst协msfcrisadaptedtop

8、hysiologicalprocedure，dec”髂e恤e1ransfern砌berandavoidmultiplepregnancyandcomp