小鼠胚胎干细胞建系和定向神经诱导分化的研究

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1、中山大学博士学位论文中文摘要小鼠胚胎干细胞建系与定向神经诱导分化的研究专业：干细胞与组织工程导师：余新炳教授；BruceT．Lahn博士研究生：张嘉晴中文摘要胚胎干细胞(embryoniCstem，ES)是指由早期胚胎内细胞团(innercellmass，ICM)分离出来并建系成功的多潜能干细胞。具有自我更新能力和多向分化潜能，能在体外无限分裂增殖，并长期保持未分化状态。可分化为全身各种类型的细胞，因具有比成体干细胞更高的增殖活性和更广泛的分化能力，在细胞治疗和组织更新领域具有巨大的潜力。目前，人们可以利用不同的培养条件将ES细胞定向诱导分化成不同类

2、型的细胞以作为细胞移植、组织替代，甚至器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多难治性疾病提供细胞来源。此外，ES细胞还是胚胎发育机制、转基因动物生成、组织更新等科研领域重要的工具细胞，但目前能够得到的小鼠ES细胞系多来自于129小鼠。而科研应用最广泛的是近交系C57BL／6J小鼠的ES细胞系很少见。神经退行性疾病(如，帕金森，老年性痴呆，癫痫等)和神经系统损伤(如中风，脑缺血，脊髓损伤等)是多发性疾病，传统的治疗方法不能阻止病情的发展，二十世纪九十年代，科学家发现神经干细胞(neuralstemcells，NSCs)中山大学博士学位论文中文摘要移植可以

3、替代死亡或退变的神经元，移植后可明显改善上述疾病的临床症状。这一成果对神经系统损伤修复和退行性疾病的治疗具有划时代的意义。一系列的动物和临床实验表明，细胞替代治疗是治疗以功能神经元减少或损伤为特点的神经系统疾病的一种理想的手段。但目前这种方法要应用到临床还受到多方面的限制，其中最主要的是细胞来源严重不足。人们曾把神经干细胞视为中枢神经系统移植和替代治疗的理想材料，但是目前已有的研究显示，NSCs在体外扩增的能力有限，而且随着传代次数的增加，分化能力和增殖能力下降。且无论胎儿还是成体的神经干细胞均来源稀少。而ES细胞可在体外无限增殖且能分化为任何成体细

4、胞，包括神经细胞。因此，ES细胞向神经方向诱导分化成为目前科学研究的热点课题。目前，对ES细胞体外诱导分化为神经干／祖细胞的研究很多，但多数诱导方法不成熟，ES细胞生成NSCs产率和纯度不高，ES细胞分化产物还是由多种细胞成分组成。而细胞移植要求大量高纯度的神经细胞。为此，本课题首先建立C57BL／6J小鼠ES细胞系，并利用胎鼠来源的神经干细胞的条件培养液作为主要诱导剂，探讨一种新的、简单高效的诱导方法，为临床细胞替代治疗提供大量的高纯度的神经细胞。全文包括三个部分：第1部分小鼠胚胎干细胞系的建立和鉴定1．目的建立C57BL／6J近交系和C57BL／

5、6J／129杂交小鼠ES系，摸索稳定可靠的ES细胞建系技术，并对获得的ES细胞系进行鉴定，为下一步诱导分化的研究提供可靠的工具细胞。中山大学博士学位论文中文摘要2．方法制备胎鼠成纤维母细胞(mouseembryonicfibroblast，MEF)作为饲养层细胞备用。促排卵3．5周龄雌性C57BL／6J小鼠，并与成年C57BL／6J或129雄鼠交配。在交配后3．5天，处死后打开腹腔，分离子宫，从两侧子宫角冲出囊胚，收集并放入有ES培养液的细胞培养皿中培养。3．5天后，从贴壁生长的囊胚中挑出内细胞团(innercellmass，ICM)消化后，种入新鲜

6、的ES培养液。随后镜下观察待饲养层细胞上出样克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起的圆形或椭圆形细胞团，即为ES细胞，常规传代培养即获得ES细胞株。对所得ES细胞株进行碱性磷酸酶染色、SSEA．1和Oct．4表达检测以及体内分化能力和核形分析。用携带绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein，GFP)基因的lentviral病毒，转染包装细胞293，获取病毒上清，用病毒上清感染SCl002ES细胞．进行GFP基因标记。3．结果所得4株ES细胞分别来自C57BL／6J和C57BL／6J×129杂交小鼠囊胚，各2株，命名为SCl001，SC

7、l002，SCl003，SCl004．4株ES细胞碱性磷酸酶染色均呈阳性，免疫组化和RT-PCR检测Oct一4均显著表达。SSEA．1染色阳性。体内分化能力检测表明，四株ES细胞均具有形成畸胎瘤的能力，镜下观察由三胚层细胞组成。核型分析均为二倍体：40，XY。携带GFP基因的lentivirus转染小鼠ES细胞成功，获得稳定表达绿色荧光蛋白的ES细胞。4．结论获得四株ES细胞分别来自C57BL／6J和C57BL／6J×129杂交小鼠囊胚，各中山大学博士学位论文中文摘要2株，命名为SCl001，SCl002，SCl003，SCl004。该细胞株均符合所

8、有胚胎干细胞的生物学特性。第2部分小鼠神经干细胞的分离培养及长期扩增体系的建立1．目的改进目前常用的分离培养