小鼠诱导多能干细胞向神经干细胞定向分化的机制研究

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名(手写)：静畴签字日期州年16月g日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的

2、复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所和中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务。本课题由国家自然科学基金项目(30960385，81160154)，江西省自然科学基金项目(2010GZY0256)资助。1名月扪导州矶吁糌蕃了触

3、卜伯蝴引矿位名F削戥碑摘要研究背景目的：诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)是一类与胚胎干细胞(emb巧omcstemcells，ESC)高度相似的全能干细胞，2006年由日本科学家Yamanaka首次获得，由于其可避开伦理、免疫排斥等问题，干细胞再生与移植治疗领域中应用前景广泛。大量研究证明iPSCs可在体外分化成神经胶质细胞、神经元及神经干细胞(NeuralStemCells，NSC)等，为脑卒中、脑外伤、帕金森(Parkinson’Sdise

4、ase，PD)、阿尔兹海默病(Alzheimerdisease，AD)等中枢神经系统疾病的细胞移植治疗带来了可能。然而iPSCs向NSC分化的确切机制目前尚未明了。iPSCs与ESC具有相似的生物学特性，大量实验证实ESC的自我更新及分化受细胞外环境、Notch信号通路、Sirtl、miRNAs等多种因素的调控。Nomh信号通路在干细胞的增殖、分化进程中均发挥着关键调控作用，Notch系统激活后干细胞增殖，而抑制Notch信号系统干细胞则分化加速；作为mir．34a下游靶基因的Sirtl对保证神

5、经元的完整性及神经发育的顺利进行至关重要。本课题组通过实验证实“RA+无血清培养基”法可提高小鼠iPSCs向NSC定向分化效率；在此基础上通过加入Sirtl抑制剂烟酰胺(nicotinamide，NAM)抑制Sial的表达，应用实时定量PCR、Westernblot、免疫荧光等方法检测神经分化过程中Notch信号、Sial、mir-34a及相关神经标志物的表达变化，初步探讨Sirtl、miRNAs及Notch信号分子等在iPSCs向NSC分化过程发挥的作用，为进一步阐明iPSCs向NSC定向分化

6、的确切机制奠定基础。方法：1．饲养层细胞的制备：取E12．5dICR小鼠胚胎，去头尾、四肢、内脏，消化成单细胞后培养，取P2_4代状态良好胚胎成纤维细胞(mouseembr)romcfibroblastcells，MEF)，10I．tg／ml的丝裂霉素C处理2．5h。2．小鼠iPSCs的培养及向NSC的诱导分化：采用RA+无血清培养基法诱导小鼠iPSCs向NSC分化，并利用免疫荧光染色鉴定分化细胞神经标志物(Nestin、SOX2、Tublin3及GFAP)的表达。摘要3．采用实时定量PCR检测

7、小鼠iPSCs向NSC分化过程各时间点Notch信号、Sirtl、mir-34a及Nestin等的表达变化。4．加入Sirtl抑制剂NAM，观察Sirtl在小鼠iPSCs向NSC诱导分化过程中的作用对及其Notch信号、mir．34a表达的影响，实验分为自然分化组、RA对照组、RA+NAM诱导组。免疫荧光染色鉴定神经标志物Nestin、SOX2、[3-tubulinlII、GFAP蛋白的表达；实时定量PCR比较小鼠iPSCs向NSC分化过程各组Notchl、Sirtl、mir-34a、Nesti

8、nmRNA的表达；Westernbolt检测各时间点Notchl、Sirtl蛋白的表达。结果：1．“无血清培养基+RA诱导法”可成功将小鼠iPSCs诱导分化为NSC。倒置荧光显微镜观察发现iPSCs经RA结合无血清培养基诱导，OCT4．GFP绿色荧光蛋白表达逐渐减少；倒置显微镜观察发现神经球贴壁培养过程不断有神经样细胞爬出，贴壁培养14天后细胞形成神经网状结构；免疫荧光染色显示细胞高表达Nestin、SOX2等神经干细胞标志物；NSC在无血清培养基中饲养2月，传至P10代仍保持良好状态。2．实时