小鼠诱导性多能干细胞的建立及其分化研究

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterGenerationofinducedpluripotentstemcellsanddif．ferentiationByXiangqianZhangSupervisor：Prof．FuguangLiDepartmentofMicrobiologyandImmunologyBasicMedicineCollegeofZhengzhouUniversitySeptember2013原创性声明

2、本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。⋯一：妒蠡日期：加fj年7月同学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授

3、权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：沥f3年7月日摘要小鼠诱导性多能干细胞的建立及其分化研究研究生：张向前导师：李付广教授郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室河南郑州450001树突状细胞(dendriticcells，DC)属于专职抗原递呈细胞，其能摄取、；DH-

4、r、处理和递呈抗原，并将后者携带的信息呈递给T淋巴细胞，进而引发一系列免疫应答，其效率是所有该类细胞中最强的。DC参与多种病理生理过程，并具有强大的免疫调节功能，因此以DC为基础的免疫治疗己成为肿瘤治疗的一种新模式。然而DC获取困难，通过患者自体骨髓问充质干细胞分离培养和扩增后获取白体内源性DC，技术操作困难，且患者难以承受，其疗效目前尚有争议，不适合临床广泛应用。通过胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)定向分化制备DC，则具有伦理学限制，而且所得DC并非自体细胞，存在免疫排斥的

5、可能。诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)技术的出现则为临床上DC的肿瘤免疫治疗所需的种子细胞的制备提供了另一种新途径。iPSCs是由体细胞诱导而成的干细胞，具有和ESC类似的发育多潜能性，在形态学、基因表达状况和表观遗传修饰方面都与ESC十分相似。iPSCs的应用价值在于获得方法相对简单和稳定，在技术上和伦理上都比其他方法更有优势，在再生医学中起着非常重要的作用。鉴于此，本研究拟通过多因子重编程技术，诱导小鼠成熟体细胞为iPSCs，并利用免疫组织化

6、学、荧光、拟胚体(EB)实验、RT-PCR及Westernblot等多项形态学和分子生物学技术对诱导而来的iPSCs进行分析鉴定。最后通过在iPSCs培养基中分别单独或联合添加不同的促使DC生长的细胞营养因子，将iPSCs在体外定向诱导分化为DC。摘要目的利用逆转录病毒载体系统，通过病毒包装技术，将小鼠成纤维细胞重编程为iPSCs并对其进行鉴定。并在此基础上，将iPSCs在体外定向诱导分化为DC。材料与方法第一部分是iPSCs的诱导与鉴定。方法如下：采用逆转录病毒转染的方法将4种外源多能因子Oct4

7、、Sox2、c。Myc、Klf4质粒转染入病毒包装Plat—E细胞，搜集病毒上清感染原代培养的小鼠鼠尾成纤维细胞，观察记录多能干细胞诱导生成的过程，并对其进行鉴定分析。主要采取以下鉴定方法，1)采用碱性磷酸酶(AP)染色观察未分化的iPSCs是否具备ESC的特征，再结合形态学和免疫细胞化学的观察，鉴定iPSCs是否具有全能性；2)采用免疫荧光的方法鉴定干细胞标志物Oct4、Sox2、SSEA．1在诱导而来的iPSCs表面的表达；3)拟胚体(EB)实验检测是否iPSCs能够分化发育成胚体，并用免疫荧光

8、的方法检测胚体中是否存在3个胚层来源细胞；4)Westernblot检测多能基因的蛋白表达：为进一步验证感染小鼠成纤维细胞的多能基因蛋白表达情况，利用Westernblot方法检测已诱导成功的iPSCs多能因子的蛋白表达情况。所用Western抗体同免疫组化抗体；5)基因表达分析(RT-PCR)：采用RT-PCR分别检测Oct4、Sox2、c—Myc、Ⅺf4多能基因在成功诱导的iPSCs、ESCM1及小鼠成纤维细胞中的表达水平，并作对比分析。．第二部分为iPSCs分化