白内障患者诱导性多能干细胞(ips)的建立及其定向分化的研究

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1、复旦大学博士学位论文白内障患者诱导性多能干细胞（iPS）的建立及其定向分化的研究姓名：邱晓頔申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：卢奕2012-03-31白内障患者诱导性多能干细胞(iPS)的建立及其定向分化的研究中文摘要年龄相关性白内障(age．relatedcataract，ARC)为全球致盲眼病的主要原因。在我国约有250万人因白内障致盲，占全球白内障致盲总数的10％。随着人口的老龄化，预计我国每年新增白内障患者将超过100万，而我国的白内障年手术量尚不足以解决每年的新增例数。因此，我国的白内障盲防治问题十分严峻。而先天性白内障是指出生前即存在，或出生后才逐渐形成的先天遗传或发育障碍的

2、白内障，超过1／3的患者是遗传所致。任何参与、影响晶状体发育的基因突变都可能导致先天性白内障的发生。因此，明确先天性白内障的发病机制对于治疗及预防先天性白内障的发生发展具有重要的意义。白内障摘除联合人工晶状体(intraocularlens，IOL)植入是目前治疗白内障最常用且效果较为理想的方法，而后囊膜混浊(posteriorcapsularopacification，PCO)是影响病人术后远期视力预后的最常见的并发症，其术后5年的发生率高达30％左右。虽然可以利用激光或者手术切开混浊的后囊膜，但是却增加了病人的经济负担，并会带来新的并发症。所以如何预防PCO的发生是眼科医生和病人都比较关注

3、的一个问题。体细胞诱导成为多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)的研究成果被国际生命科学界誉为具有里程碑意义的创新之举。多能干细胞能够自我更新，能在体内外分化成几乎所有类型的细胞，在再生医学等方面有巨大的应用潜力，具有极高的理论研究价值。通常用来源于囊胚期胚胎的内细胞团的胚胎干细胞、通过核移植得到的胚胎干细胞以及在成体细胞中转入外源转录因子得到的iPSCs，进行体细胞重编程研究。在短短数年的时间里，此项研究已经在细胞重编程的机理研究、探索疾病的发生发展机制以及临床医学的应用等领域引发了很多突破性的进展；而且这一非克隆干细胞技术的诞生，成功地避开了长期以

4、来争论不休的伦理问题，极大地推动该领域和相关科学领域的发展。与胚胎干细胞研究相比，体细胞重编程技术可以为更多的患者提供特异性多能干细胞。因而，在医学应用方面(例如器官培养和器官移植等)有广阔的前景。患者特异性的多能干细胞的建立能够为疾病发病机制的研究、治疗药物的筛选及细胞移植治疗提供有力的工具。采用慢病毒载体将外源性转录因子导入白内障患者晶体上皮细胞，从而获得诱导性多能干细胞。白内障患者来源的多能干细白内障患者诱导性多能干细胞(iPS)的建立及其定向分化的研究胞的建立，能够为晶体发育、细胞分化、衰老提供便利的细胞模型，同时可为白内障治疗药物的筛选及白内障发病机制的研究提供有力的研究工具。第一部

5、分原代人晶体上皮细胞的体外培养目的对正常人晶体、年龄相关性白内障晶体上皮细胞及人皮肤成纤维细胞进行体外培养，并观察体外培养的晶体上皮细胞及皮肤成纤维细胞的生物学特性及组织学变化。方法正常人晶体上皮细胞培养取材于角膜移植术后供体眼的晶状体囊膜，年龄相关性白内障晶体上皮细胞培养取材于白内障超乳手术中撕除的晶体前囊膜。角膜移植术后供体眼的晶状体沿赤道部后方约2mm环形剪开后囊膜，小心取下完整的前囊膜和赤道部囊膜，剪成lmm×lmm大小的组织块，利用组织块贴片法，进行原代人晶状体上皮细胞的培养。白内障晶体前囊膜在超乳手术中完整取材、洗去粘弹剂之后剪成lmm×lmm大小的组织块，利用组织块贴片法进行培养

6、。使用O．25％胰酶溶液对融合后的细胞进行消化传代。取年龄相关性白内障患者的皮肤组织，剪成lmm3大小的组织块，过夜消化，离心收集细胞，经多次传代后，获得较为纯化的皮肤成纤维细胞进行培养。在倒置相差显微镜下对三种细胞进行形态学观察。采用CCK．8法连续7天测定三种细胞的增殖速率，绘制生长曲线并进行比较。结果正常人晶体囊膜组织块贴壁48～72小时后可见人晶状体上皮细胞从组织块边缘长出，约10"-15天达到融合。初期正常人晶体上皮细胞为多角形，胞体透亮，细胞边界清晰。融合后的细胞具有上皮细胞的形态特征，为典型的六角形或多边形。在体外细胞可传五代，但第三代以后细胞表型向成纤维细胞转化。第三代以后正常

7、人晶体上皮细胞胞体呈梭形或长条形。第五代正常人晶体上皮细胞老化，胞浆内出现大小不等的空泡样改变，最后崩解死亡。白内障患者晶体上皮细胞形态与增殖能力与正常晶体上皮细胞相类似，但部分白内障晶体上皮细胞与正常人晶体上皮细胞形态差异较大，更接近成纤维细胞，且细胞在第一次传代后即老化崩解。人皮肤成纤维细胞伸展呈梭形或多边形，在经过多次培养传代后，可得到较为纯化的成纤维细胞。CCK．8法绘制的生长曲线表明人皮