《体外诱导生成人诱导性多能干细胞及向肝细胞样细胞分化的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
＾Ｈ■＾网＾Ｂ＾＾ｕＩＨｓｓｌｍｉｓｌ 分类号：Ｒ５１２．６密级：公开体外诱导生成人诱导性多能干细胞及向肝细胞样细胞分化的研究ＴｈｅＳ化ｄｙｏｆ化ｅｉｎｄｕｅ村ｏｎｏｆｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐ山ｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ化ｈｅｐａｔ：ｏｃｙｔｅｌｉｋｅｃｅｌｌｓｉｎｖｉ化〇？作者姓名：王建军学科专业：内科传染病导师：辛绍杰、貌盼勇教授答辩委頂会主席：论文答辩日期—：二０五年五月二十八日院校地址：北京市复兴路２８号邮政编码：１００８５３ 解放军医学院研究生学位论文原创性声明＂＂、，秉承我院忠诚敬业、和谐、创新的学风本人声明：所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证书而使用过的材料，对本文的研究作出贡献的个人或集体，均已在文中做了明确的说明并表示谢意。＾申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担切相关责任。论文作者签名：：ｖｙ．．討家刖月兴Ｘ指导教师签名；户备円期：抑４７＾解放军医学院研究生学位论文版权使用授权书本人保证毕业离院后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为解放军医学院或解放军总医院、复。学院有权保留并向国家有关部口或机构送交论文原件印件和电子版本，可Ｗ采用影印、缩印、扫描或其它手段保存论文Ｗ供被查阅和借阅。。学院可Ｗ公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外）：：八ｒ论文作者签名２采杏円期义，指导教师签名刖月：户心 解放军医学院博＋学位论文目录中ｉ摘耍１英ｉ摘耍三３前胃５一第部分人包皮成钟维细胞诱导生成诱导性多能干细胞８材料与方法８实验结果１９ｉ城２２２４小拿第：＿：部分诱导性多能干细胞的多能性的鉴定２５材料与方法２５实验结果３２職３５小结３７第二部分Ｉｐｓ细胞诱导为肝细胞样细胞３８材料与方法３８实验结果４９職５２小５４Ｓ第四部分Ｉｐｓ细胞对小鼠肝损伤恢复的影响的初步研究５５材料与方法５５实验结果５７６讨论１小结６３总结６４参考ｉ献６５文献综述７０攻读学位期间发表文章情况７８ｍ７９ｉｉ 解放军睦学院博＋学位论文作者：王建军学科专业：内科传染病学导师：辛绍杰、貌盼勇体外巧导生成人巧导性多能干细胞及向肝细胞样细胞分化的研究中文摘要研究背景：目前针对肝衰竭的治疗手段中最有效的为肝脏移植治疗但由于，供体的严重短缺无法进行普遍推广。人工肝支持系统可哲时脊代肝脏功能，，帮助病人渡过肝衰竭危检期等待肝細胞再生，或维持病人生存至得到合适的供体进行肝移植。生物人工肝是目前认为最理想的人工肝，但其发展受限于肝细胞来源问题。干细胞由于具有转化为各种类型组织细胞的能力，可能为人工肝治疗的肝细胞新的来源。胚胎干细胞可具有良好的多潜能性，可分化为多种人体组织细胞，但其应用受到伦理学的限制。自体骨髓间充质干细胞私外周血干细胞获取数量有眼，难Ｗ建立细胞系，不能满足生物型人工肝所需要护增的数量及也不够稳定。诱导性多能干细胞与胚胎干细胞同样具有自我更新、增殖和分化的特性却，，避免了应用胚胎干细胞研究所需要面临的伦理问题和法律问题，可Ｗ避免目前常用的异种及肿瘤巧细胞应用于生物人工肝的主要缺点可能成为治疗终末期肝衰，竭新的肝細胞来源，其临床应用将具有广阔的前景。目的一：将人包皮成纤维细胞ｓ细胞诱导为，进步诱导为肝细胞样細胞为ｉｐ，人工肝支持治疗提供新的肝细胞来源。＇Ｓｏｘ２Ｋ－Ｍ方法：Ｗ逆转录病毒为载体将Ｏｃｔ４ｌｆ４和ｃｃ，，ｙ因子导入人包皮成纤维细胞中，在体外应用ｈＥＳ细胞专用培养体系，培养病毒感染后体细胞促使其，一诱导为ｉＰＳ细胞。进步通过ＡＰ染色、免疫焚光染色，核型鉴定、类胚体形成、脖胎瘤形成等实验鉴定所诱导的ｉＰＳ細胞具有类似ＥＳ细胞的全能性。对实验中所获得的ｉｐｓ細胞，在体外经加入不同的刺激因子，诱导ｉｐｓ细胞先分化为内化层細胞，进而分化为肝细胞样細胞。诱导过程中各阶段的标志物经免疫烫光染色及流式染色验证分化效率。获得的肝细胞样细胞经Ｅｌｉｓａ方法检测ＡＬＢ的分泌量ＰＡＳ，民Ｔ－ＰＣ民及Ｒｅａｌ－ｔＣ民检测染色检测糖原胆存功能ｉｍｅＰ特异性基因的表达。诱导，１ 解放军控学院博＋学位论文的ｉｐｓ细胞经茨光标记后经尾静脉注射入急性肝损伤的Ｃ５７小鼠体内，了解ｉｐｓ细胞是否对肝损伤有治疗作巧。结果：成功从人包皮成纤维细胞诱导出ｉｐｓ细胞，鉴定其有类似ＥＳ细胞的多潜能性，对实验中所获得的咕Ｓ细胞，在体外经加入不同的刺激因子，诱导获得了具有成熟肝细胞的功能的肝细胞样细胞。诱导的ｉｐｓ细胞经烫光标记后经尾静脉注射入急性巧损伤的Ｃ７小鼠体一５内，对肝功能损伤具有定的恢复作用。结论一：人包皮成纤维细胞可诱导为ｉｓ细胞进步诱导为肝细胞样细胞可ｐ，，能为生物人工巧治巧衰竭潜在的肝细胞来源。关键词：人包皮成纤维细胞，重编程，诱导性多能干细胞，肝细胞样細胞２ 解放军較学院博十学位论文Ｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｏｔｅｎｔｐｐｓ化ｍｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｔｏｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｌｉｋｅｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ．ＡｂｓｔｒａｃｔＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ：Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｔｈｅｍｏｓｔｅｆｅｃｔｉｖｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｌｉｖｅｒｆａｉｌｕｒｅｉｓｌｉｖｅｒ化ａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂ山ｄｕｅｔｏｄｉｅｓｅｖｅｒｅｓｈｏｒｔａｇｅｏｆｄｏｎｏｒ，ｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｃａｎｎｏｔｂｅｏｕ．Ａｒｔｔｔｔｔｅｌａｒｉｚｅｄｉｆｉｃｉａｌｌｉｖｅｒｓｕｏｒｔｓｓｅｍｃａｎｒｅｌａｃｅ；ｈｅｌｉｖｅｒｆｕｎｃｉｏｎｍｏｒａｒｉｌｐｐｐｐｙｐｐｙ，ｈｅｌｐａｔｉｅｎｔｓｌ；ｈｒｏｕｈｌｉｖｅｒｆａｉｌｕｒｅｒｉｓｋｆｂｒ化ｅｒｅｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｌｉｖｅｒｃｅｌｌｓ，ｏｒｔｏｍａｉｎｈｉｎｐｇｇ化ｅｓｕｒｖｉｖａｌｔｏｅｔｓｕｉｔａｂｌｅｄｏｎｏｒｓｆｂｒｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｌａｎｔａｔｉｏｎ．ＢｉｏｌｏｉｃａｌａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｉｖｅｒｉｓｇｐｇｃｕｒｒｅｎｔｌｙＣＯ打ｓｉｄｅｒｅｄｔｈｅｍｏｓｔｉｄｅａｌａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｉｖｅｒ，ｂｕｔｉｔｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅ打ｔｉｓｌｉｍｉｔｅｄｂｙｔｈｅｏｒｉｇｉｎｒｏｂｌｅｍｏｆｌｉｖｅｒｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍｃｅｌｌｓｈａｖｅｔｈｅａｂｉｌｉｔｔｏｏｒａｎｉｚｅｉｎ化ｖａｒｉｏｕｓｔｅｓｏｆｐｙｇｙｐｃｅｌｌｓｍａｂｅｔｈｅｎｅｗｓｏｕｒｃｅｏｆｌｉｖｅｒｃｅｌｌｓｆｏｒａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｉｖｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｅｍｂｒｏｎｉｃｓｔｅｍ，ｙｙｃｅｌｌｓｈａｖｅｏｏｄｌｕｒｉｏｔｅｎｃｃａｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏａｖａｒｉｅｔｏｆｈｕｍａｎｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｃｅｌｌｓｇｐｐｙ，ｙ，ｂｕｔｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｓｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｂｙｅｔｈｉｃｓ．Ａ山ｏｌｏｏｕｓｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｍａｌｓｔ：ｅｍｇｙｃｅａｅｒｅｒａｌｂｏｏｄｓｔｅｍｃｅｓａｒｅｌｔｔｏｏｂｔａｉ打ｅｎｕａｎｔｉｎｏｔｅａｓｔｏｌｌｓｎｄｉｐｈｌｌｌｄｉｆｉｃｕｏｕｈｑｔｙｐｇ，ｙｅｓｔａｂｓａｃｅｌｌｌｉ打ｅａｎｄｄｉｆｉｃｕｌｔｏｍｅｅｔ化ｅｒｅｕｉｒｅｄｕａｎｔｉｔａｎｄｄｅｒｅｅｏｆｓｔａｂｉｌｉｔｏｆｌｉｈｔ，ｑｑｙｇｙｂｉｏｌｏｉｃａｌａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｉｖｅｒ．Ｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｌｉｋｅｅｍｂｒｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｈａｖｅｇｐｐ，ｙ，ｔｔｔｔｔｌｆ－ｔｄｔｔｏ打ｔｈｅｏｉｏｅ打ｏｆｓｅｒｅｎｅｗａｌｒｏｌｉｆｅｒａｉｏ打ａ打ｄｉｆｅｒｅｎｉｄｔｈｔｃｓａｎｄｉａｉｂｕａｖｏｅｅｈｉｐ，ｐ，ｌａｗｏｂｓｌ：ａｃｌｅｓｔｈｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｒｅｓｅａｒｃｈｈａｄｂｅｅｎ枯ｄｎｇ，ａｖｏｉｄＴｈｅｍａｉｎｄｉｓａｄｖａｎｔａｅｏｆ化ｅｃｏｍｍｏ打ｄｉｓｓｉｍｉｌａｒａｎｄｔｕｍｏｒｌｉｖｅｒｃｅｌｌｓｕｓｅｄｉｎｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｉｖｅｒａｔｇｔ－ｒｅｓｅｎｍａｂｅｃｏｍｅａ打ｅｗｓｏｕｒｃｅｏｆｔｔｍｅｎｔｔｌｉｖｅｒｃｅｌｌｓｏｆ化ｅｒｅａｏｆｅｎｄｓａｅｌｉｖｅｒｐ，ｙｇｆａｌｈｏｓｅｃｔｓｏｆｃｉｉｃａｔｏｎｉｕｒｅａｓｂｒｏａｄｒｌｎｃａｌａｌｉｉ．，ｐｐｐｐＡｉｍ；Ｉ打ｏｒｄｅｔｏｐｒｏｖｉｄｅａｎｅｗｓｏｕｒｃｅｏｆｃｅｌｌｓｆｏｒａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｉｖｅｒｓｕｐｐｏｒｔｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｈｕｍａｎｆｏｒｅｓｋｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｏｉＰＳｃｅｌｌｓａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｏ，ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｌｉｋｅｃｅｌｌｓ．Ｍｅｌｈｏｄ－Ｍ：Ｉ打化ｉｓａｅｒＯｃｔ４Ｓｏｘ２Ｋ４ａｎｄｃｃｅｎｅｗｅｒｅｔｒａｎｓｄｕｃｅｄｉｎｔｏ：ｐｐｌｆ，ｙｇ，，ｈｕｍａｎｆｏｒｅｓｋｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｂｙｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｉ打ｖｉｔｒｏ．ＴｈｅｖｉｍｓｉｎｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｈＥＳｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｓｅｍａｎｄｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｏｉＰＳｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｌｕｒｉｏｔｅｎｃｏｆｙ引，ｐｐｙｉＰＳｃｅｌｌｔｉｌｌｓ１化ｅＥＳｃｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉ打ｅｄｂＡＰｓｅｉｎｉｎｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓａｉｎｎｙｇ，ｇ，ｋａｒｙｏｔｙｐｅａｎａｌｙｓｉｓ，ｅｍｂｒｙｏｉｄｂｏｄｙｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｎｄｕｍｂｉｈｃａｌｅｍｂｒｏｔｕｍｏｕｒｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ｙＴｈｅｏｂｔａｉ打ｅｄｉＰＳｃｅｌｌｓｗ巧ｅａｄｄｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔ：ｏｒｉｎｖｉｔｒｏ．ＩＰＳｃｅｌｌｓｗｅｒｅｆｉｒｓｔｎｄｕｃｅｄｎｔａｔｏｎｉｎｏｅｎｄｏｄｅｒｍｃｅｓａｎｄｈｅｎｎｔａｔｅｔｏｈｅａｏｃｔｅｌｙｉｄｉｆｆｅｒｅｉｉｔｌｌ，ｔｄｉｆｆｅｒｅｉｐｔｙ１化ｅｃｅｌ．Ｔｏｃｅｓｓｏｆｉｎｄｕｏｖｅｄｔｏｂｅｃｏｒｒｅｃｔｂｍｍｕ打ｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｌｓｈｅｐｒｃｅｄｗ巧ｅｐｒｙｉ３ 解放军睦学院博＋学位论文ｓｅｉｎｉｎｇａｎｄ円０Ｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｕｓｅｄｍａｒｋｅｒｓｏｆｅａｃｈｓｌ；ａｇｅ，化ｅｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｅｆｉｃｉｅｎｃｙｉｓｈｉｈＥｌｉｔａｔｔＡＬ目ｔｆｔｔｌｉ．ｓａｍｅｈｏｄｗｓｕｓｅｄｆｏｒｄｅｅｃｉｏｎｏｆｓｅｃｒｅｉｏｎｏｉｅｈｅａｔｏｃｅｋｅｃｅｌｌｓｇｐｙ，ＰＡＳｔ－ｓａｉｎｉｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｌｃｏｅｎｓｔｉ民ＴＰＣ民ａｎｄ民ｔＰＣ民ｇｇｙｇ：ｏｒａｇｅｆｍｃｔｉｏ打ｅａ＾ｉｍｅ，ｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔ；ｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏ打ｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅ．ＩＰＳｃｅｌｌｓｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｌａｂｅｌｅｄｉｎｅｃｔｅｄｉｎＣ５７ｍｉｃｅｗｉｔｈａｃｕｔｅｌｉｖｅｒｆａｉｌｕｒｅｖｉａｔａｉｌｖｅｉｎｉｎｍｉｃｅ化ｕｎｄｅｒｓ化ｎｄｗｈｅ化ｅｒｊｔｈｅ巧Ｓｃｅｌｌｓｈａｖｅａｒｏｌｅｉｎ化ｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｌｉｖｅｒｉｎｊｕｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｈｕｍａｎｆｔ）ｒｅｓｋｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｉｎｄｕｃｅｄｔｏｉＰＳｃｅｌｌｓａｎｄｗｅｒｅ，ｉｄｅｎｔｉ巧ｅｄｔｏｈａｖｅ化ｅｌｕｒｉｏ化打ｃｓｉｍｉｌａｒｔｏＥＳｃｅｌｌｓ．ＴｈｅｏｂｔａｉｎｅｄｉＰＳｃｅｌｌｓｉｎ化ｅｐｐｙ＊ｅｘｅｒｉｍｅｎｔｉｎｖｉｔｒｏｗｅｒｅａｄｄｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｓｔｉｍｕｌａｔｉｎ化（：１：〇１化ｅｎ化ｅｉＰＳｃｅｌｌｓｗｅｒｅｐｇｇ，ｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｏ化ｅｈｅｐａｔｏｃｙｔｅＵｋｅｃｅｌｌｓｗｉｔｈｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｆｉｍｃｔｉｏｎ．ＩＰＳｃｅｌｌｓｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｌａｂｅｌｅｄｉｎｅｃｔｅｄｉｎＣ５７ｍｉｃｅｗｉｔｈａｃｕｔｅｌｉｖｅｒｆａｉｌｕｒｅｖｉａｔａｉｌｖｅｉｎｉｎｍｉｃｅｊｈａｄｃｅｒｔａｉｎｒｏｌｅｉｎ化ｅｒｅｃｏｖｅｒｏｆ．ｙｌｉｖｅｒｆｉｉｎｃｔｉｏｎｄａｍａｅｇＣｏｎｃｌｕｔｉｏｍ：Ｈｕｍａｎ扣ｒｅｓｋｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｃａ打ｂｅｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｏ巧Ｓｃｅｌｌｓ，ａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｏｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｌｉｋｅｃｅｌｌｓ，ｍａｙｂｅｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｓｏｕｒｃｅｏｆｌｉｖｅｒｃｅｌｌｓｆｏｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｉｖｅｒｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｌｉｖｅｒｆａｉｌｕｒｅ．ＫｅｙＷｏｒｄ：ｈｕｍａｎｆｏｒｅｓｋｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｓ，ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ，ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏ化ｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｈｅａｔｏｃｔｅｌｉｋｅｃｅｌｌｓ，ｐｙ４ 解放军医学院博＋学位论文—１—刖吕由于各种原因所引起的巧功能损伤和肝功能衰竭严重威胁着人类的健康，由此而导致的病死率高。目前，肝衰竭的主要治疗手段主要有Ｈ种：内科药物治疗、人工肝支持治疗和肝脏移植治内科综合治疗疗效不佳，肝衰竭的病死率可达？到５０％７０％左右；目前已证实的有效治疗手段为肝移植，但由于供体的严重短缺，无法进行普遍推广人工巧支持系统可Ｗ暂时替代肝脏功能，帮助病人渡过；肝衰竭危险期等待肝细胞再生，或维持病人生存至得到合适的供体进行肝移植。生物人工肝（ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｉｖｅｒ，ＢＡＬ）是目前认为最理想的人工肝，由于引入肝细胞，它不仅具有解毒功能，而且还具有类似肝细胞的代谢和合成能力，但目前为一止，全世界还没有套成熟的生物人工肝装置上市，制约其发展的主要问题就是如何获得足够的肝细胞来源。理想的用于ＢＡＬ的肝细胞应具有人源化正常分化表型易获取易于培；；容；养。；生物功能稳定等特点。理论上生物人工肝中最理想的细胞材料是成人肝细胞成人肝细胞的生物安全性好，在细胞生物学上具有相同功能，还可Ｗ提供与同源的肝细胞分泌的生物活性物质，，。但是成人肝细胞数量匿乏价格昂贵细胞分离困难，活力难Ｗ长时间维持。较成人肝细胞而言，胎肝细胞分离较为容易，活力好，能检测到培养肝细胞合成分泌的白蛋白和甲胎蛋白，但受其来源及伦理学的，建立肝细胞库十分困难限制。异种哺乳动物如猪、鼠、兔等的肝细胞具有广泛的来源、价格比较便宜，并且有比较成熟的肝细胞的分离培养技术，研究较多。迄今为止，生物人工肝支持装置中应用最多的是猪的肝细胞，已经有比较多的临床研究，并且还有部分研究己进入，ＩＩ／ＩＩＩ期临床研究但在猪体内广泛存在内源性逆转录病毒（ｏｒｃｉｎｅｅｎｄｏｅｎｏｕｓｒｅｔｒｏｖｉｒａｌＰＥＲＶ），治疗ＰＥＲＶ交ｐｇ，中有叉传染人的可能性，其次需要考虑的是应用中的免疫反应问题，由于抗猪肝细胞抗体ＩｇＭ在少数冗常人体内存在，如果治疗中有猪的肝细胞或其所分泌的细胞因子等进入患者体内，就有可能引起急性排斥反应，因此猪肝细胞的推广仍然是应用者的顾虑。一肝肿瘤细胞株是由人讯癌的组织中分离，些正常、克隆而来的具有肝脏细胞的功能，ＨｅＣＣ３Ａ细胞ＥＬＡＤ生ｐＧ２、３Ａ是比较典型的肝癌细胞化应用株的物一ＩＩ人工肝装置在中国的Ｉ期临床研究中取得定疗效，但致瘤性的Ｋ险仍然使其推ｗ广应用受限制ｔｉ。５ 解放军医学院博±学位论文干细胞由于具有转化为各种类型组织细胞的能力，成为近年来细胞替代治疗的研究热点，可能为人工肝治疗的肝细胞新的来源。干细胞可大致的分为化胎干细胞（ＥＳＣｓ）、间充质干细胞（ＭＳＣｓ）和诱导性多能干细胞（ｉＰＳＣｓ），ＥＳＣｓ可具有良好的多潜能性，可分化为多种人体组织细胞，但其应用受到伦理学的限制。自体骨髓间充质干细胞和外周血干细胞获取数量有限，建立细胞系困难，不能满足生物型人工肝治疗所需需要扩增的细胞数量及获得稳定程度，且在患者患严重肝病一情况下获取有定困难，不易被患者接受ＩｎｄｕｃｅｄＰｌｕｒｉｏｔｅｎｔ。诱导性多能干细胞（ｐＳｔｅｍＣｅｌｌｓｉＰＳＣ，、，）与胚胎干细胞类似同样具有自我更新自我増殖和自我分化潜一能，却避免了胚胎干细胞应用临床研究所直面临的伦理问题和法律问题等诸多障碍，又不存在目前常用的异种及肿瘤肝细胞在应用于生物人工肝治疗是所存在的主要缺点，可能成为治疗终末期肝衰竭新的细胞来源，其临床应用将具有广阔的刖景。诱导性多能干细胞Ｓｏｘ２Ｋｌ－Ｍ（ｉＰＳ）是将四种转录因子（Ｏｃｔ４ｆ４ｃｃ或，，和ｙ０ｃｔ４，Ｓｏｘ２，ＮＡＮＯＧ和Ｌｉｎ２８）的姐合转入体细胞中，使其重新编程，分化为类一Ｗ似胚胎干细胞的种细胞类型。目前己有许多研究表明ｉＰＳ细胞可Ｗ诱导成多种体细胞：近年来的研究已经发现ｉＰＳ细胞可Ｗ诱导成为成熟肝细胞，并在动物实验中证实将其移植至免疫缺陷鼠体内，由ｉＰＳ诱导的肝细胞具有增殖能力并能逐步代替其肝脏功能。这些发现为肝脏疾病的治疗提供了广阔的前景，提示我们可Ｗ利一用体细胞获取有増殖能力的ｉＰＳ细胞，从而获取同遗传背景来源的肝前体细胞（ｈｅｐａｔｉｃｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ）或成熟肝细胞用于临床。－在本实验中，我们Ｗ逆转录病毒为载体将化ｔ４Ｓｏｘ２Ｋｌｆ４ＣＭｙｃ因，，和子导入人包皮成纤维细胞中，应用ｈＥＳ细胞专用培养体系，培养病毒感染后体细胞，一ｉＰＳ，步通过ＡＰ染色，促使其诱导为细胞进、免疫巧光染色核型鉴定、类胚体形成、化胎瘤形成等实验鉴定所诱导的ｉＰＳ细胞具有类似ＥＳ细胞的全能性。诱导的ｉｐｓ细胞经萊光标记后经尾静脉注射入急性肝损伤的Ｃ５７小鼠体内，可在小鼠体内增殖，改善肝损伤小鼠的肝脏炎症改变ｉｓ。所获得的ｐ细胞经诱导成功分化为了巧细胞样细胞。诱导过程中各阶段的标志物经免疫巧光染色及流式染色验证正确，分化效率高ＬＢＰＡＳ。获得的肝细胞样细胞经Ｅｌｉｓａ方法检测Ａ的分泌量，染－－色检测糖原胆存功能，ＲＴＰＣＲ及ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ检测特异性基因的表达，提示通６ 解放军控学院博＋学位论文一过诱导获得了成熟肝细胞的功能的肝细胞样细胞ｉｓ。为进步通过体细胞诱导ｐ细胞，进而诱导出功能性的肝细胞应用与临床提供了初步的实验基础。７ 解放军医学院博＋学位论文第一部分人包皮成纤维细胞诱导生成诱导性多能干细胞引言＾ｙ２日０６年８月，Ｔａｋａｈａｓｈｉ和Ｙａｍａｎａｋａ通过在分化的胎鼠成纤维细胞中表达０ｃ－ｔ４ｏｘ２、ｃＭｙｃ和Ｋｌｆ４（也称为Ｙａｍａｎａｋａ因子），诱导体细胞四种转录因子、Ｓ。的重新编程，进而获得了与化胎干细胞功能相似的细胞这些细胞具有不断自我，更新，因此被命名为诱导性多、自我分化的能力具有发展为各种细胞的潜能性能性干细胞。２００７年１１月，Ｔａｋａｈａｓｈｉ和化ｍａｎａｋａ又利用同样的转录因子化ｔ４、’１－ｌＳｏｘ２、ｃＭｙｃ和Ｋｆ４将人的皮肤成纤维细胞重新编程为ｉＰＳ细胞。２００７年１２月一ｔ４２ＮａｎｏＬＹｕＪ等通过筛选，应用另外基因组合０ｃ、Ｓｏｘ、ｇ和ｉｎ２８诱导建立了ｂｊ人的ｉＰＳ细胞。ｉＰＳ细胞与胚胎干细胞同样具有自我更新、自我增殖和自我分一化的特性，却避免了胚胎干细胞应用于临床研究直所面临的伦理问题和法律和。问题等障碍，有可能在未来在临床中广泛的应用于细胞替代治疗ｉＰＳ细胞可Ｗ诱导成多种体细胞，可Ｗ从同目前己有多项研究表明；理论上一ＰＳ个病人身上获得ｉＰＳ细胞。目前，Ｗｉ细胞为，并用于器官移植或基因治疗基础的细胞治疗己经建立了许多动物病理模型，并获得了令人鼓舞的结论。人源＾ＰＳＣｓ样具有向肝细胞系分化的潜质２０１０年，科学家的ｉ细胞已经证明可和＾。成功的将ＰＳ，该细胞具有完全的肝细胞功能，包括分ｉ细胞诱导成为成熟巧细胞＂’Ｗ泌白蛋白、储存糖原、合成尿素等；同年也有研究显示移植至免疫缺陷鼠体内由ｉＰＳ诱导的肝细胞具有増殖能力并能逐步代替其肝脏功能这些发现为肝脏疾病的治疗提供了广阔的前景，提示我们可Ｗ利用体细胞获取有增殖能力的ｉＰＳ细一胞，从而获取同遗传背景来源的肝前体细胞或成熟肝细胞用于临床。化ｔ４Ｓｏｘ２Ｋｆ４－Ｍ，ｌＣ在本实验中我们Ｗ逆转录病毒为载体将，：和ｙｃ因子导入人包皮成纤维细胞中，应用ｈＥＳ细胞专用培养体系，培养病毒感染后体细胞，促使其诱导为ｉＰＳ细胞。‘一、材料和方法１．实验材料：１．１实验动物及细胞：－逆转录病毒包装细胞ｐｌａｔＥ：由本实验室保存提供。昆明鼠来源于我院动物实８ 解放军医学院博＋学位论文验中也。人包皮成纤维细胞来源于我院外科口诊新鲜成人包皮环切术后标本。１．２主要试剂；试剂名称生产商０．０５％膜酶思赛因公司＇丝裂霉素－Ｃｉ（ＭＭＣ）德国ｓｇｍａ公司￣－ｐｏｌｒＤｌｙｓｉｎｅ／多聚赖氨酸德国ｓｉｇｍａ公司ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＬＴＸａｎｄＰｌｕｓｒｅａｇｅｎｔ美国ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司Ｏ－？－ｉｉｔｐｔｉＭＥＭＩＲｅｄｕｃｅｄＳｅｒｕｍＭｅｄｕｍ美国ｉｎｖｒｏｇｅｎ公司＊基因转染增强剂Ｆ〇ｌｙｂｒｅｎｅ德国ｓｉｇｍａ公司人ｉＰＳ细胞完全培养基（含血清）思赛因公司人ｉＰＳ细胞建系培养基（无血清）思赛因公司人类ｉｐｓ细胞条件培养基思赛因公司ＩＣＲ饲养层细胞思赛因公司成纤维细胞培养液思赛因公司成纤维细胞冻存液思赛因公司人化胎干细胞／ｉＰＳ细胞冻存液思赛因公司０．１％明胶德国Ｓｉｇｍａ公司ＰＢＳ美国Ｇｉｂｅｏ公司青霉素－链霉素溶液赛施公司１．３试剂配方：（０人ｉＰＳ细胞完全培养基（无血清）１００ｍｌ：含ＤＭＥＭ／Ｆ１２７６ｍｌ，ＫＯＳＲｌＯｍｌ，Ｘ－ＸＩＨｉｌｕｔａＭａｘ（ｌＯＯＸ）１ｍｌ，ＮＥＡＡ（ｌＯＯ）１ｍｌ，目Ｍｅｃ叩ｔｏｅｎｔｈａｎｏｌ（ｌＯＯ）１ｍｌ，Ａｎｔ－ｔＸｍｌｉＡｎｉ（１００）１，ＢＦＧＦ（ｌＯＯｕｇ／ＭＬ）４ｕｌ。（２）人ｉＰＳ细胞建系培养基（无血清）１００ｍｌ：含ＤＭＥＭ／Ｆ１２７６ｍｌ，ＫＯＳＲｌＯｍｌ，－－ｌ＾ＧｌｕｔａＭａｘ（ｌＯＯＸ）１ｍｌ，ＮＥＡＡ（ｌＯＯＸ）１ｍｌ，目Ｍｅｃａｐｔｏｅｎｔｈａｎｏｌ（ｌＯＯＸ）１ｍｌ，－ＡｎｔＡｎｔｉｉ（ｌＯＯＸ）１ｍｌ，ＢＦＧＦ（ｌＯＯｕｇ／ＭＬ）Ｓｕｌ。１Ｘ（３）成纤维细胞培养液００ｍｌ；含ＤＭＥＭ８７ｍｌ，ｒａＳｌＯｍｌ，ＮＥＡＡ（ｌＯＯ）１ｍｌ，Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｌＯＯＸ）１ｍｌ，ＳＰｌｒａｌ〇（４）成纤维细胞冻存液５０ｍｌ：含ＤＭＳＯ５ｍｌ，ＦＢＳ３５ｍｌ，成纤维细胞培养基５ｍｌ，９ 解放军医学院博＋学位论文高糖ＤＭＥＭ５ｍｌ（日）人胚胎干细胞＾ＰＳ细胞冻存液１００ｍｌ：含ＤＭＳＯ１０ｍｌ，ＦＢＳ７０ｍｌ，人化胎干细胞／ｉＰＳ细胞培养基１０ｍｌ，高糖ＤＭＥＭ１０ｍｌ１．４质粒及逆转录病毒载体：ＰＭＸ－０ｃ－－－－－ｔ４、ＰＭＸＳｏｘ２、ＰＭＸＫｌｆ４、ＰＭＸＣＭｙｃ、ｐＭＸＧＦＰ，及含有０ｃｔ４、Ｓｏｘ２－、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃ、ＧＦＰ的逆转录病毒均购自思赛因公司。１．５主要器材：名称厂家３１细胞培养皿（．５ｃｍ、６ｃｍ、０ｃｍ）丹麦Ｎｕｎｃ公司细胞培养板（４孔、６孔、１２孔、２４孔）丹麦Ｍｕｎｃ公司细胞培养瓶（Ｔ巧，Ｔ７５）美国康宁公司移液管（２ｍｌ，５ｍｌ，１０ｍｌ，巧ｍｌ）法国ＧＩＬＳＯＮ公司离必管（１５ｍｌ，５０ｍｌ）思赛因公司冻存管美国Ａｘｙｇｅｎ公司０．５／１．５ｍｌＥＰ美国Ａｘｙｇｅｎ公司管滤膜（０．４５ｕｍ，０．２２ｕｍ）美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司５％Ｃ０２培养箱上海为康设备有限公司超净工作台苏州净化设备厂倒置镜德国Ｌｅｉｃａ公司体视镜德国Ｌｅｉｃａ公司微型离也机珠海黑马医学仪器公司Ｓｉｇｍａ３Ｋ１８台式高速低温冷冻离也机德国Ｓｉｇｍａ公司’ＰｎＥＴＭＡＮ⑨移液器法国ＧＩＬＳＯＮ公司移液枪法国ＧＩＬＳＯＮ公司电热恒温水浴锅北京东方精瑞公司２实验方法２．１流程图１０ 解放军ｆｅ学院博＋学位论文目的细胞获得病毒包装濁养廢制毎—…－－……ｉＰＳ懲导ｒｉＥＢ形成ｆ、—１ｉＰＳ扩ｉ９ｉＩ－ＩｊｊＰＳ冻咨ｉｉＰＳ扩增ｉｈｉＪｉＡＰｉ！Ｔ染怪＇ｉ巧慶器Ｉｉ；Ｉ－＾－ｉｉＰＳ裝定叫多能性碌思黨因输到免殺藥光染療Ｉ？Ｉ！誦鉴违Ｉ２．２巧养层的制备２．２．１ＭＥＦ（Ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）原代取材（１１）：２）比例合笼。每天早）性成熟母小鼠与种公鼠按公Ｕ母（竿上观察母小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物（阴道栓）即确定为怀孕。见栓当天上午定为怀孕的化５ｄ。准备１３．日天孕鼠。（２）事先高压灭菌好所用器械（内用外用分开）内用：眼科弯剪，弯头，攝子。外用：大剪刀，大摄子，小剪刀，小镜子并用。采用断颈法处死孕鼠一７５％酒精消毒；先用套手术器械迅速剪开下腹部，暴露呈串珠样排列的子宫；一，解剖剪剪去两端附着组织再用套新手术器械中的綴子提拉出全部子宫，将成串子宫全部浸入预冷的含２％Ｐ－Ｓ的ＰＢＳ溶液中；（３）子宫放在预冷的ＰＢＳ溶液中漂洗王次，洗去子宫表面附着血细胞和一组织眼科剪将个个子宫分别剪开，，剥离胎鼠将分离出的胎鼠置于新的盛；一ＰＢＳ０－有的培养皿中（般可获得１１２只胎鼠）；弯摄配合，去除胎鼠的头、尾、四肢、内脏，保留躯干部位，置于新的盛有ＰＢＳ的培养皿中；眼科剪将３組织块剪碎成Ｉｒａｎ左右大小，用Ｐａｓｔｅｕｒ管收集组织块至１加１离必管，离必ｌＯＯＯｒｐｍ，３ｍｉｎ；４－５ｍ（入０．２５％Ｔｒｉｎ邸ＴＡ，室温作用ｉｎ，）加ｙｐｓ伴移液管轻柔连续吹打１１ 解放军医学院博＋学位论文１０待大组织块消失后加入等体积成纤维培养基终止消化Ｉ离也０日巧ｍ，３ｍｉｎ；一皿的密度接种皿里加入７ｍ每只胎鼠个１０ｃｍ：先在１０ｃｍｌ成纤维培养基，然后把离也好的细胞弃掉上清，加入１ｍｌ成纤维培养基，８字摇匀，放入Ｃ０２培一一ＰＢＳ养箱培养。换培养基，Ｓ：把旧培养基弃掉加入洗下，弃掉阳，Ｒ更最后加入新鲜培养基。第王Ｒ传代或冻存。２．２．２ＭＥＦ传代－（１１０ｃｍ８０％９０％）的培养皿中。观察细胞长到密度。２一ｌＰＢ（，３ｍＳ，）将原液弃掉加入洗下并弃掉２－３２１（３）加入１１１０．２日％肤酶，放入培养箱消化［１１〇左右，在显微镜下观察细胞变圆，而且漂起来，立即加入等量成纤维培养基，用移液枪来回吹扣，并收集到１５ｍｌ离也管，－４、１ｉ上清屯，按照传代比例（１：１：４），０００１１，３ｍｎ。弃３接种。（）离巧２．２．３ＭＥＦ冻存一－ｒａ（１到８日％９０％密，３ｌＰＢＳ，）观察细胞长度。将原液弃掉加入洗下并弃掉上清液。２入２ｍｌ０．２５％，２ｍｉｎ，（）加族酶放入培养箱消化左右在显微镜下观察细胞变圆，立，用移，，而且漂起来即加入等量成纤维培养基液枪吹打收集到巧ｍｌ离也管，（３）离也，１０００巧ｍ，３ｍｉｎ。弃掉上清，加入成纤维细胞冻存液，混匀。４，５ｍｌ，，（）准备冻存管每个冻存管加入化冻存液并标记上细胞名称代次，复苏比例，，冻存人冻存时间等相关信息。°５－把冻存管放入冻存盒后，直接将冻存盒放入８０Ｃ。过夜后，转入液氮（）长期保存。２．２．４ＭＥＦ苏复‘一１管冻存细胞，立即放于３７Ｃ水浴锅中，摇晃，直至冰（）从液氮中取＇晶刚刚完全融化。２立即拿到超净台一滴一（），将冻存液移到１５ｍｌ离也管中，再滴的加入５ｍｌ成纤维细胞培养基。１ｉｌＸ６－ｗｅ化０）离必，０００：ｒｐｍ，３ｍｎ。弃上清，按照冻存比例ｌｌｐｌａ接种。１２ 解放军医学院博＋学位论文４－隔Ｒ换液，并每天观察细胞状态。大概２３天后可传代。（）２．２．５ＭＥＦ伺养层的制备－－（１）观察ＭＥＦ巧Ｐ４长到８０％９０％的密度。一２０．１％，室３０ｍｉｎ，ＰＢＳ（）用明胶包被培养皿温洗遍，等待接种细胞。０）Ｍ即长满后，ＰＢＳ洗２遍，加入新鲜的ＭＥＦ培养基和ＭＭＣ（ｌＯｕｇ／ｍｌ），－化之后用排Ｓ洗２遍ＴＥ放入培养箱，２ｈ。加入０．＾％消化，放入培养箱，２ｍｉｎ。４察细胞变圆，漂起后，加入等量的培养液终止消化。用移液枪来回（）观ｊｍｎ－Ｘｃｍ吹打，并收集到巧ｌ离必管，离也ｌＯＯＯｒｍｐ，３ｍｉ按３４ｌ〇Ｙ接种。－（５）置培养箱中静置过夜，使其贴壁。铺好的饲养层在１７天内有效，都可心支持ｍＥＳ生长并维持其全能性２．３目的细胞的获得２．．３１人包皮成纤维细胞（册Ｆ）原代培养（１）无菌手术获取人包皮组织１００ｍｍ。将包皮组织放在的培养皿中，迅ＰＢＳ－ｌ１５速用清洗掉脂肪和坏死组织，切成２ｍｍ３小片段。然后将其转移到ｍｌ离也管中。离也ｌＯＯＯｒｐｍ，２ｍｉｎ。（２）用ｍｌ成纤维培Ｔ２５中Ｐａｕｓｔｅｕｒ１养基重悬组织块，转移至，用将组织块均匀分布，小也吸出多余的培养液。培养瓶倒貴，放在３７ｔ培养箱中培养过夜。（３）第二天，略微巧松培养瓶的盖子，加入１．５毫升培养基，每周换液３次。（４－）３７天后可Ｗ看到细胞从姐织块周围爬出，当有足够的细胞－８０％－（７０汇合），用０．２５％肤蛋白酶ＥＤＴＡ进行传代并接种在１００毫米培皿再培养一养，每２天更换次培养基。２．３．２人包皮成纤维细胞（ＨＦＦ）培养８０－（１）％，在显微镜下观察，细胞长得非常致密，密度大概在９０％准备进行传代。ＰＢＳ洗一（２）将原，２ｍｌ０．２５％膜液弃掉，加入２ｍｌ下将ＰＢＳ弃掉。加入酶，放入培养箱，２ｍｉｎ。在镜下观察，细胞变圆并漂起来后，加入２ｍｌ成纤维细胞培养液终止消化。１３ 解放军医学院博±学位论文、（３）吹打，收集，离屯，ｌＯＯＯｒｐｍ，３ｍｉｎ。弃上清，用４ｍｌ成纤维培养基４’ｌｘｌ２７将细胞悬浮，然后ＷＯ个活细胞／ｃｍ移到６孔板上，放入３Ｃ培养箱中培养。（４）第二天，将制备的ＨＦＦ细胞可通过逆转录病毒感染。２－－－－－．４ＰＭＸ０ｃｔ４、ＰＭＸＳｏｘ２、ＰＭＸＫｌｆ４、ＰＭＸｃＭｙｃ质粒的扩増－－－－－－２．４．１ＰＭＸｃｔ４、Ｐ、ｌｆ４、ｃｃｓ０ＭＸＳｏｘ２ＰＭＸＫＰＭＸＭｙ质粒转化入ＴｒａｎｌＴ１感受态细胞－（１）各质粒分别取化ｌｕｌ力化０ｕｌＴｒａｎｓｌｎ感受态细胞中（在感受态细胞－刚刚解冻时加入连接产物），轻弹混匀，冰浴２０３０ｍｉｎ。°（２）４２Ｃ热激３０秒，立即置于冰上２ｍｉｎ。°（３）力胆５０Ｈｉ平衡至室温的ＳＯＣ／ＬＢ，２００转，３７Ｃ赔育１小时。４＾－（）取８１１，５００ｍＭＩＰＴＧ，４０ｕｌ，２０ｍｇ／ｍｌＸｇａｌ泡合，均匀地涂于’准备好的平板上，在３７Ｃ放置３０ｍｉｎ。巧ＰＴＧＸ－）待Ｉ，ｇａｌ被吸收后，取２００Ｈｉ菌液铺板，培养过夜（为得到４日００－１１０１５０较多克隆，巧ｍ离也ｍｉｎ，弃掉部分上清，保留０ｕｌ，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜）。（６）挑选白色克隆接种于ＬＢ／Ａｍｐ的液体培养基中，过夜培养。２．４．２细苗质粒的小量提取及鉴定！（１）取过夜培养的菌液，１０，ＯＯＯＸｇ离也Ｉｍｉｎ，尽量吸尽上清。（２）加入巧０ｕｌ无色溶液ＲＢ（含ＲＮａｓｅＡ），震荡悬浮细菌沉淀，不应留有小的菌块。ＬＢ－（３）加入巧日ｕｌ蓝色溶液，温和地上下翻转混合４６次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，颜色由半透亮变为透亮蓝色，指示完全裂解（不宜超过５ｍｉｎ）。４－（）加入３５０ｕｌ黄色溶液ＮＢ，轻轻混合５６次（颜色由蓝色完全变成黄色，指示混合均匀，２ｍｉｎ。，中和完全），直至形成紧实的黄色摄集块室温静置（５）１２，ＯＯＯＸｇ离私５ｍｉｎ，小也吸取上清加入吸附柱中。（６）１２，ＯＯＯＸｇ离弃流出液。７入閒０ｕＢ、（）加ｌ溶液Ｗ，巧，ＯＯＯＸｇ离屯Ｉｍｉｎ，弃流出液。１４ 解放军医学院博＋学位论文－１２ＯＯ，２ｍＷＢ（８），ＯＸｇ离ｌＭｉｎ，彻底去除残留的。＾－（９）将吸附柱置于干净的离必管中，在柱的中央加入３０５０郎或去离Ｈ〉７ｉ子水（ｐ．０）室温静置Ｉｍｎ。（１０）１０，ＯＯＯＸｇ离必Ｉｍｉｎ，洗脱ＤＮＡＤＮＡ，洗脱出的送测序。－－２－－－ｃｃ．４．３ＰＭＸ０ｃｔ４、ＰＭＸＳｏｘ２、ＰＭＸＫｌｆ４、ＰＭＸＭｙ质粒扩増与应用去内毒素质粒提取试剂盒大量抽提质粒－－－－－（１）取前述含经测序鉴定正确的ＰＭＸ０ｃｔ４、ＰＭＸＳｏｘ２、ＰＭＸＫｌｆ４、ＰＭＸＣＭｙｃ°质粒的茵液各ｌＯＯｕｌ接种于５ｍｌＬＢ培养基，３７Ｃ，３（Ｋ）ｒｐｍ过夜培养。°－（２）取１００２００ｕｌ上述菌液接种于ｌＯＯｍｌＬＢ培养基中，３７Ｃ，３００ｒｐｍ摇床－化ｈ培养１４。’）００ｍｌ４Ｃ，（３将培养后的１。机，６００化离也１５ｍｉｎ。弃上清液菌液应用离。（４）加入１０ｍｌＢｕｆｆｅｒ門使沉淀的菌斑重悬，注意要重息均匀。然后加入Ｂｕｆｆｅｒ２－１０ｍｌＰ，立４６，５ｍｉｎ。即轻柔颠倒次，使菌液彻底混匀室温静置加入－１０ｍｌＢｕｆｆｅｒＰ３立刻轻柔颠倒４６，立即放置冰上，次，使细菌裂解液彻底混匀僻育州ｍｉｎ。（５）取试剂盒提供的注射器针筒，垂直放置与试管架上，将细菌裂解物倒入ｌ，注射器针筒内，室温下静置Ｏｍｉｎ，然后取下注射器前的旋帽并将注射器活塞轻一轻推入针筒内，使细菌裂解物过滤到个清洁的５０ｍｌ的离也管内。（６）滤过液中加入２．５ｍｌＢｕｆｆｅｒＥＲ，上下颠倒混匀，共约１０次，冰上赔育３０ｍｉｎ〇－ｉ５００（７）将ｌＯｍｌＢｕｆｆｅｒＱＢＴ加入ＱＩＡＧＥＮｔｐ中ｙＡ平衡柱子，通过重为使其自然流空。（８）小也吸取第６步获取的裂解液经静置后的上清液移入柱子，使其通过重力作用自然通过滤膜。（９）应用３０ｍｌＢｕｆｆｅｒＱＣ清洗柱子，共清洗２次１５ｍｌ。清洗后的柱子中加入ＢｕｆｆｅｒＱＦ洗脱ＤＮＡ，收集洗脱液，送里面含有目的ＤＮＡ。’（１０）为沉淀ＤＮＡ，在洗脱液中加入０．７倍体积的异丙醇。立刻混勻，应用４Ｃ１５０００ｇ离也３０ｍｉｎｍｌ７０％乙醇溶液１日００化离也离也机。。小必弃上清。加入日，ｌＯｍｉｎ。弃上清液ＯｍｉｎｌＯＯｕｌＰＨＳ．Ｏ，获得。空气中干燥沉淀ｌ，用的化溶解沉淀１５ 解放军轻学院博＋学位论文目的ＤＮＡ。用分光光度计测０Ｄ值，计算核酸浓度。２．５病毒制备３－２；．５．１包装细胞９１１６准备°将冷冻细胞从液氮中取出，立３７Ｃ水即放入浴中，待冰晶刚刚完全化完。１ｉ，加入０，０００ｍ３ｍｎ。将细胞悬液吸入培养瓶中１倍新鲜培养液离必巧，弃上清，接种于Ｔ７５瓶中，培养，长满Ｗ后１：５传代，传到１０ｃｍ细胞培养皿上，提３０ｍ－前ｉｎ在１０ｃｍ铺上ＰＤＬ（多聚赖氨酸）。ｐｌａｔＥ长到７０％８０％时，进行转染。２．５．２病毒包装－－－（１）将ｐｌａ巧细胞的培养液换成ｏｐｔｉＭＥＭ７ｍｌ。用ＩｍｌｏｐｔｉＭＥＭ溶口版０－Ｓｏｘ２－Ｋｆ４ＰＭＸ－－Ｍ＂４、ＰＭＸ、ＰＭＸｌ、ｃｙｃ质粒，共加２４ｕｇ质粒，再加入２４ｉｌ｜ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ，轻弹ＥＰ管混匀，室温温巧５ｍｉｎ。（２）加入４８山ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＬＴＸ，轻弹ＥＰ管混匀，室温温巧３０ｍｉｎ。（３）逐滴的加入到提前换好ｏｐｔｉＭＥＭ的培养液的ｐｌａ巧细胞培养皿。置于°３７Ｃ，５％Ｃ０２培养箱过夜培养。°（４）培养１化后，换成不加双抗的成纤维细胞培养液，置于３７Ｃ，５％Ｃ０２培养箱培养２４ｈ。’（５）２４ｈ后收集上清，再加入不加双抗的成纤维细胞培养液，貴于３７Ｃ，‘５％Ｃ０２培养箱培养２４ｈ。收集的病毒置于４Ｃ保存。一（６）２仙后再次收集上清。和前天的起保存。２．５．３病毒浓缩ｍ一（１）收集后的病毒首先进行ｌＯＯＯｒｐ，５ｍｉｎ的离也，去除部分ｐｌａｔＥ细胞。（２）０．４５ｕｍ的滤器过滤病毒，完全去除ｐａ化用ｌ细胞。（３）过滤后的病毒分批用誦．００化的过滤柱过滤，过滤前用ＰＢＳ把柱子润湿，力日ＰＢＳ５ｍｌ后离也ＳＯＯＯｒｐｍ，３ｍｉｎ，然后把柱子里的ＰＢＳ吸出来。°（４）往柱子加１５ｍｌ的病毒，４０００ｇ，４Ｃ窝必２０ｍｉｎ。°－（５）收获浓缩病毒２００ｕｌ左右。分装成小包装８０Ｃ冻存备用，可长期保存。２．５．４用ＧＦＰ的病毒进行滴度的测定化细胞一５（１）首先要复苏ｐａｌ般密度为１０Ｚ？Ｌ化孔极第二天换成２ｍｌ的１６ 解放军陸学院博＋学位论文无双抗的成纤维细胞培养液（２）加浓缩的病毒，设有０．５山，１此２ｕ，５此１０山等梯度，另外同时加有的ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ来增强感染效率。感染后的２４小时换液。（３）４化后观察巧光，７２ｈ观察巧光照相和固定细胞做流式检测ＧＦＰ的阳’性率。（４）滴度（ＴＵ）的测定公式：如果加ｌｕｌＧＦＰ的浓缩病毒有１０％的２９３Ｔ细胞５＝ｘｘ＝为阳性的话，滴度１０％ｔａｒｇｅｔｃｅｌｌｎｕｍｂｅｒｓｙｌ〇化ｒｐａｌｔＥｃｅｌｌｓ／０．００１ｍｌ）６レ１０ＴＵ／ｍ＝ｌ。四因子在感染成纤维细胞时用的ＭＯＩ５，也就是１个成纤维细胞给５个病毒。－２Ｋ－－－（５）按ＭＯＩ为５的病毒量把携带Ｓｏｘ、ｌｆ４、Ｏｃｔ４、ＣＭＹＣ基因四个，ｍｌ因子的病毒同时加到事先接种好的成纤维细胞里同时加４ｕｇ／ｌｐｏｙｂｒｅｎｅ，应用携带ＧＦＰ基因的逆转录病毒上清液作为对照组感染细胞，用于初步判断逆转’录病毒感染ＨＦＦ细胞效率，置于３７Ｃ，５％Ｃ０２培养箱培养，４８小时后倒置显微镜观察含ＧＦＰ病毒感染效率。２．６ｉＰＳ细胞诱导２．６．１ｉＰＳ建系（１）诱导流程围病辜转导目的沮胞接种到商养层细胞上．井巧悟赛皇更巧成昭胎干细胞恒养皇出现巧隆＃收集巧隆矿增巧陸的鉴定Ｉ＇￣…，，化＾色。………―）一＂？ＳＩＩ０６７２８８６１８０（２）诱导过程５Ｄ－１レ１０６ａｙ：接种成纤维细胞到每个孔板的孔Ｄａｙ化按ＭＯＩ为５的病毒量把四个因子的病毒同时加到事先接种好的成’纤维细胞里，同时加４ｕｇ／ｍｏｌｂｒｅｎｅ，成纤维细胞培养液不加ｓ。３７Ｃ，ｌｐｙｐ置于５％Ｃ０２培养箱培养。Ｄａｙ１：换液，从今天开始可Ｗ加ｓｐ的成纤维培养液。Ｄａｙ３：换液，观察细胞。Ｄａｙ５：换液，观察细胞，并准备饲养层。１７ 解放军医学院搏＋学位论文一Ｄａ＂７：感染第ｔ天的成纤维细胞这个时候细胞开始聚集在起ｙ。如果感染效率比较高的话会出现小的克隆，此时可Ｗ用０．２５％膜酶把细胞消化成单细胞接种到饲养层上，仍然用成纤维细胞的培养液。Ｄａｙ８：弃去成汗维细胞培养液，换成ｉＰＳ建系培养基。Ｄａ１化换巧Ｓ建系培养基，仔细观察这个时候应该会开始出现小的克隆ｙＤａｙ１１ａｎｄＤ巧１３：继续换液并观察克隆，这个时候克隆逐渐长大，重编程１３过程需要更多的营养，送个时候液体颜色容易变化，ｄ后细胞每天都必须进行－４ｍ换液，如果液体颜色在变黄的话，每个六孔板加３ｌ的液体。一Ｄａｙ１４：送个时候开始准备挑克隆，提前天准备饲养层，选择用２４孔板进行第一一次的克隆挑取，般在挑克隆之前进行人胚胎干细胞特异性的膜蛋白标一－－－－志ＴＲＡ１６０的活细胞染色ＴＲＡ１６０，阳性的克隆是完全重编程的克隆，般情况是可进行传代稳定成系的克隆。Ｄａｙ１５：成纤维种到饲养层后的第屯天，饲养层细胞活力逐渐变小，有些开始调亡，这个时候开始加条件培养液。Ｄ巧１７及其Ｗ后：挑取克隆后传代及其鉴定２．６．２免疫巧光检测病毒转染ＨＦＦ细胞后细胞内的四种蛋白的表达。（１）固定册Ｆ细胞；册Ｆ细胞感染病毒４８小时后，加入２００山４％ＰＦＡ，室溫放置３０ｍｉｎ，弃掉４％ＰＦＡ，ＰＢＳ洗Ｈ遍（２）通透；加入２００ｕｌ０．０５％ｔｒｈｏｎ，室温放置３０ｍｉｎ，弃掉ｔｒｉ化ｎ，ＰＢＳ洗Ｓ遍（３）封闭：加入２％ＢＳＡ，室温放貴Ｉｈ。弃掉２％ＢＳＡ，加新鲜２％ＢＳＡ２００ｕｌ°（４）染色：Ｗ１；２００比例在各孔中加入四种转录因子对应的＾＾［，４Ｃ过一一夜。第二天弃掉抗，ＰＢＳ洗Ｈ遍，每遍放在摇床上５ｍｉｎ。最后次清洗去除ＰＢＳ后加入２００ｕ，ｌ，ｌ２％ＢＳＡｕｌ对应的二抗室温避光放置化。（５）染核：ＲＮＡ酶１：１０００，０．５ｍｌＰＢＳ，０．：５ｕｌＰＩ，室温放置ｌＯｍｉｎ（６）封片；把圆形玻片放貴载玻片上，用透朗指甲油固定住。（７）在倒置巧光显微镜下观察染色结果。２．６．３挑克隆一（１）提前天准备饲养层细胞。１８ 解放军医学院博±学位论文（２）先把饲养层细胞换成人诱导多能性干细胞完全培养液。在镜下观察，根据克隆大小来确定是否要进行挑克隆。（３）将体视镜周围用酒精消毒，然后点上酒精灯。用弯头绩子配合，将玻璃针烧成合适的长度和角度。将细胞放在体视镜上，用烧好的玻璃针将好的克隆挑出来。（４）用１０山的枪头将克隆吸出来，打到提前换成ｉＰＳ培养液的ｆｅｅｄｅｒ上，放３－４入培养箱培养。天传代。２．６．４ｉＰＳ传代培养一（１）提前天准备饲养层细胞。（２）先把饲养层细胞换成人诱导多能性干细胞完全培养液。在镜下观察，根据克隆大小和密度来确定是否传代。一（３）把ｉＰＳ培养液弃掉，用ＰＢＳ洗下，加入适量ＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅｔｙｐｅＩＶ－ｍｎ＂ｍｇ／ｍＬ，放入培养箱５１５ｉ。）（４）镜下观察细胞变圆，克隆边缘卷起，加入等量成纤维培养基进行终止消化。（５）吹化收集，离也，ｌＯＯＯｒｐｍ，３ｍｉｎ。弃上清，按照１：３左右密度接种在己经换好液的饲养层上。２．６．５ＩＰＳ细胞冻存一（１）需要冻存的ＰＳ２清洗遍，加入０．０５％族酶，５％ｉ细胞应用ＤＭＥＭ／Ｆ１在°的二氧化碳培养箱中，３７Ｃ消化３ｍｉｎ。（２）用移液枪头将消化后的ｉＰＳ细胞克隆从孔板表面刮起，收集到离必管中，应用室温离也机ｌ〇５８ｒｐｍ，离也５ｍｉｎ，弃上清液。（３）在去除上清液的离也管中小也的逐滴加入巧Ｓ细胞冻存液，轻轻振荡混１（、匀细胞，按ｍｌ／每冻存管分装注意标明细胞名称代数、冻存时间），将冻存管°－二放入程序降温盒中，在８０Ｃ冰箱过夜。，第天转移到液氮罐中长期保存二、结果１．ＭＥＦ饲养层细胞的准备：一－地贴壁原代的小鼠ＭＥＦ细胞在接种后３，细胞般呈长梭形、也可呈多边型一－４－或不规则形，３８０％９０％的密，第二代后的细胞纯度较高般代的细胞长到度１９ 解放军医学院博±学位论文（如图１）可作为饲养层细胞用于诱导ＩＰＳ细胞。圓图８０－９０％ＥＦ１密度有的Ｍ饲养层细胞２－ｌＥ．ＧＦＰ的ａｔＷ含病毒作为对照，观察逆转录病毒转染ｐ细胞效率－－包装逆转录病毒转染ｐｌａｔＥ４８小时，在倒置萊光显微镜下观察明暗视野下的ｐｌａｔＥＦＰｔ－细胞，可见暗视野下含Ｇ的病毒转染的绝大部分ｐｌａＥ细胞发出绿色巧光（图Ａ－２、Ｂ，表明ｐａｔＥ细胞感染ＧＦＰ基因的逆转录病毒的比例９０％Ｗ上。）ｌ圓画２ＦＰ－Ｅ细（１Ｘ图含Ｇ的病毒转染ｐｌａｔ胞４８小时后巧光显微镜下观察０）Ａ明视野，Ｂ暗视野．３．免疫巧光检测病毒转染ＨＦＦ细胞后细胞内的四种转录因子ｃ－含有Ｏｔ４Ｓｏｘ２Ｋｌｆ４和ｃＭｙｃ四种因子的逆转录病毒质粒转染ＨＦＦ细胞，４８，，小时后，应用免疫巧光检测病毒感染后的细胞，在倒置巧光显微镜下观察到干细２０ 解放军医学院博古学位论文ｃ－４Ｓ０Ｘ２ｍ胞标记因子Ｏｔ、、ｃｙｅ、ｋｌｆ４呈阳性的绿色炎光（图３），提示四种目的蛋白在目的细胞内已获得表达。＾ＳＩＨＩ图３病毒转染ＨＦＦ细胞４８小时后免疫巧光检测四种蛋白的表达（４００Ｘ）４．１ｐｓ细胞的诱导；ＷＭＯＩ为５的病毒量把四个因子的病毒同时加到事先接种好的成纤维细胞里，一同时加４ｕｇ／ｍｌｐｏｌｙｂｒｅｎｅ，感染第六天的成纤维细胞送个时候细胞开始聚集在起。用化２５％膜酶把细胞消化成单细胞接种到饲养层上，仍然用成纤维细胞的培养液。９０－Ｂ第天开始换巧Ｓ建系培养基，第１天就可Ｗ观察到小的克隆（图４），至１５天克隆増大－Ｃ＾（图４），可式准备挑取克隆进行细胞传代。ｍｍ图４Ｈ町细胞诱导Ｉｓ００Ｘ．．ｐ的过程（１）：Ａ细胞诱导第０天，Ｂ细胞诱导第１０天，Ｃ．细胞诱导第巧天。２１ 解放军医学院博±学位论文（５．无饲养层条件下可见人ｉｐｓ细胞生长形态，细胞扁平，较高核质比图５）５图无饲养层条件的人ｉｐｓ细胞Ｈ、讨论Ｉｓ细胞的发现ｓ细胞与ＥＳ细胞类似，ｐ，在科学史上具有里程碑的作用。Ｉｐ一具有自我更新、増殖和分化的特性，却没有ＥＳ细胞研究及应用于临床直不得不面对的伦理问题和法律问题，是目前细胞替代治疗研究热点。对于医学领域来说，ｉＰＳ细胞最重要的贡献在提供了体外研究疾病的模型，有利于更好地研究疾病发病。的机理，有助于筛选新的药物，开发新的治疗方法目前的有关人和动物的相关研究己经发现ｉＰＳＣｓ、也，可Ｗ成功分化为神经元ｓ肌细胞、族岛细胞、内皮细胞、血细胞等多种组织细胞。在动物实验中有报道ｉＰＳＣｉＰＳＣｓ可Ｗ用于修复受损的组织，如将小鼠诱导的也肌细胞植入小鼠也肌内，进梗死的小鼠必肌细胞的收缩功能可Ｗ改善通过向帕金森病大鼠的纹状体内植Ｗ入ｉＰＳＣｓ分化的多己胺神经元，进而可Ｗ改善帕金森病大鼠的旋转行为等。２００７年ｎｎａＰＳ。，Ｈａ等报道用ｉ细胞可Ｗ使小鼠的谦状红细胞贫血症获得成功的治疗Ｘｕ等用将ｉＰＳ细胞诱导为内皮前体细胞和内皮细胞，用于治疗血友病Ａ，也获得了成功ｉＰＳ细胞可应用于基因治疗。同时，ｉＰＳＣｓ。这些在动物中进行研究验证了Ｍ一Ｆａｎ应用人类细胞的研究也取得了定的进展。Ｒａｙａ等选择对ｃｏｎｉ贫血症病人进行研究，对病人的成纤维细胞进行遗传修饰后在重新编程，获得了特异性ｉＰＳ细一胞，这些ｉＰＳ细胞通过进步分化，所形成的髓系和红细胞系的造血干细胞具有正一ＤＮＡ常表型。Ｌｕ等建立了种在诱导过程中排除了病毒的干巧的系统，可Ｗ将ｉＰＳ细胞高效的诱导成正常红细胞。这些细胞可临床应用于血液病人身上，对于某２２ 解放军医学院博＋学位论文一些血液疾病患者的治疗具有重要意义，，对于些罕见血型患者也可Ｗ为其提供一上具有巨大的潜力血细胞。这些研究进步显示了ｉＰＳ细胞在临床治疗。＾１为疾病的研究提供体外模型，这也是９５细胞对于医学医学的另个最重要的贡献。为研究许多特殊疾病发生发展机理，疾病特异性ｉＰＳ细胞可Ｗ作为重要工具。Ｗ２００８年，Ｄｉｍｏｓ等对肌萎缩侧索硬化症患者进行研究，将病人的皮肤细胞诱导为ＰＳ一ｉ，步分化成运动神经元后Ｐａｒｋ细胞并进，建立了肌萎缩侧索硬化症疾病模型。Ｗ等选择了多种不同遗传病的患者，将各种患者的体细胞诱导为病人特异性的ｉＰＳＷ细胞系１０种特２００９年，Ｌｅｅ等应用用ｉＰＳ细胞建立了家族，建立了异的疾病模型。Ｆａｍ一性植物神经功能不全症ｉｌｉａｌｄｔｏｎｏｍｉａ即）的细胞模型。通过利用送（ｙｓａｕ，。疾病模型：送些细胞不，可Ｗ筛选特异性的治疗该疾病药物他们通过研究发现能正常分化为神经元细胞，通过利用送种差异可Ｗ来衡量巧巾己被提议作为治疗即的候选药物的药物疗效一一，迭几种药中，激动素就是其中种。这项技术第次对来一，自患者的疾病相关细胞类型进行检视，也第次表明激动素能用于神经系统疾病进而改善神经细胞疾病病情，提供了可Ｗ使用激动素进行长期治疗ＦＤ患者最好的一证据。当然，ｉＰＳＣｓ诱导的疾病模型还是有些限制，如体外研究的疾病模型受细ｉＰ胞类型和培养环境的影响，如果体外环境因素真的影响ＳＣｓ的性质和分化情况，体外重建的病人特异性的疾病模型是否能真正反应疾病的真实情况就值得质疑Ｗ２＂ＰＳＣｓ。另外，疾病病理生理表现的复杂性不可能仅仅通过疾病特异性的ｉ就可一些难治性疾病中Ｗ解释。因为在，细胞与细胞的相互作用也起到十分重要的作Ｗ一用种表现复杂的疾病。。因此，单独通过某种细胞或细胞成分不足Ｗ完全模拟一基于上述原因，目前ＰＳＣｓ疾病些单基因的遗传家族型ｉ模型的建立主要考虑的是疾病。在本实验中，我们获得了人包皮成纤维细胞，并获得了原代培养的ＭＥＦ细胞作为饲养层细胞，应用经典的ｉＰＳ诱导方法，Ｗ逆转录病毒为载体将０ｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｋ－ｌｆ４和ｃＭｙｃ等四种转录因子导入人包皮成纤维细胞中，应用ｈＥＳ细胞专用培养体系，培养病毒感染后体细胞，感染４８小时后，应用免疫巧光检测发现四种蛋白１在细胞内表达为阳性，病毒诱导第０天起，出现类似ＥＳ细胞的小的圆形或楠圆形细胞克隆，细胞克隆逐渐长大，克隆内可，边界清晰见排列紧密的圆形或梭形细胞，细胞之间边界不清楚，细胞核大，核／质比高，增殖活跃，出现小的克隆约２３ 解放军医学院博击学位论文己－７ＥＳ，提示获得了样的细胞天后即可传代，并且细胞克隆具有持续増殖的能力，一一也开始准备进步的有关ｉｐｓ细胞功能的进步盜定。四、小结ｃ－４－－ｌｆ－４ＨＦＦ本研究通过应用含有Ｏｔ、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、Ｋ基因的逆转录病毒，将细胞在体外诱导为ｉＰＳ细胞。２４ 解放军接学院博±学位论文第二部分巧导性多能干细胞的多能性的鉴定引言与ＥＳ细胞类似ｓ细胞也具有自我更新、增殖和分化的全能性，所Ｗ无论，ｉｐＥＳ在形态学、表观遗传学、分子水平、细胞水平及动物实验上，都有类似细胞的特性一，却绕开了防细胞研究及应用与临床直不得不面对的伦理和法律等诸多障碍。ＥＳ细胞在体外培养时呈集落样生长，可Ｗ无限增巧，具有向多种组织细胞分化的能力。体外ＡＰ实验阳性，可Ｗ表达与体细胞不同的多种特异性的内源性基因，－－－－－；＾ＳＥＡ４％ＥＡ３、Ｔｒａ１６０如、、Ｎａｎｏｇ、Ｔｒａ＾８１等。在体内动物实验中，可Ｗ在免疫缺陷小鼠中形成崎胎瘤。本实验中，人包皮成纤维细胞诱导为ｉＰＳ细胞后，与诱导前的细胞特性明显一不同，发生了系列类似防细胞的变化，前述的实验中所获得的ｉｐｓ细胞可Ｗ在一ＥＳＡＰ染色、免疫体外无限传代，形态学上己经类似细胞，我们进步通过体外癸光染色，核型鉴定，、类化体形成、体内的晴胎瘤形成等实验验证了我们所诱导的ｉＰＳ细胞具有类似ＥＳ细胞的全能性。一、材料和方法１．实验材料：Ｉ１．动物及细胞：ＳＣＩＤ鼠来源于我院动物实验中必。ＩＰＳ细胞来源于上述实验由人包皮成纤维细胞所诱导。１．２主要试剂：试剂名称生产商０．０５％膜酶思赛因公司人ｉＰＳ细胞完全培养基（含血清）思赛因公司ＩＣＲ饲养层细胞思赛因公司人胚胎干细胞／ｉＰＳ细胞冻存液思赛因公司碱性麟酸酶染色试剂盒斯丹赛公司人类ＥＳ／ｉＰＳ细胞表面标记物鉴定抗体试剂盒斯丹赛公司０．１％明胶德国Ｓｉｇｍａ公司２５ 解放军医学院博＋学位论文￣ＰＢＳ美国Ｇ化ｅｏ公司青霉素－链霉素溶液赛施公司ＲＸＡ反转录试剂盒ＴａＫａ化公司细胞总ＲＮＡ提取试剂盒ＴａＫａ化公司１．３试剂配方：（０人ｉＰＳ细胞完全培养基（无血清）１００ｍｌ；含ＤＭＥＭ／Ｆ１２７６ｍｌ，ＫＯＳＲｌＯｍｌ，Ｌ＿－－Ｇ（ｌＯＯＸ）１ｍｌ，ＮＥＡＡ（ｌＯＯＸ）１ｍｌ，目Ｍｅｃａｐｔｏｅｎｔｈａｎｏｌ（ｌＯＯＸ）１ｍｌ，ＡｎｔｉＡｎｔｉ（ｌＸ）１ｍｌ，（ｕ）ｌＯＯＢＦＧＦｌＯＯｇ／ＭＬ４ｕ。（２）人胜胎干细胞／ｉＰＳ细胞冻存液１００ｍｌ：含ＤＭＳＯｌＯｍｌ，邱Ｓ７０ｍｌ，人胚胎干细胞／ｉＰＳ细胞培养基１０ｍｌ，高糖ＤＭＥＭ１日ｍｌ１４．主要器材：名称厂家细胞培养皿（３．５ｃｍ、６ｃｍ、１０ｃｍ）丹麦Ｎｕｎｃ公司细胞培养板（４孔、６孔、１２孔、２４孔）丹麦Ｎｕｎｃ公司细胞培养瓶（Ｔ２５，Ｈ５）美国康宁公司移液管（２ｍｌ，５ｍｌ，１０ｍｌ，２５ｍｌ）法国ＧＩＬＳＯＮ公司离如管（１５ｍｌ，５０ｍｌ）思赛因公司冻存管美国Ａｘｙｇｅｎ公司０５１５．／．ｍｌＥＰ管美国Ａｘｙｇｅｎ公司００２２ｕｍ滤膜（．巧ｕｍ，．）美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司５％饼２培养箱上海力康设备有限公司超净工作台苏州净化设备厂倒置镜德国Ｌｅｉｃａ公司体视镜德国Ｌｅｉｃａ公司Ｍ－ｉｆｌｉ６Ｋ微型离私机珠海黑马医学仪器公司—Ｓｉｇｍａ３Ｋ１８台式高速低温冷冻离必机德国Ｓｉ卵ａ公司ＰｒＴＥＴＭＡＮ⑨移液器法国ＧＩＬＳＯＮ公司移液枪法国ＧＩＬＳＯＮ公司电热恒温水浴锅北京东方精瑞公司２６ 解放军医学院博＋学位论文２．实验方法２．１ＩＰＳ细胞的碱性磯酸酶Ａ化ａｌｉｎｅｈｏｓｈａｔａｓｅｅ，Ａ（ｐｐ巧染色检测（１）复苏ＭＥＦ细胞，将其接种到四孔板中，第二日将待测的ｉＰＳ细胞接种到ＭＥＦ饲养层细胞继续培养两天。弃培养液液，ＰＢＳ洗兰遍。（２）２００ｕｌ＞／ＰＦＡ，３０ｍｉｎ。固定细胞；加入〇多聚甲酸（室温放置）（３）４％ＰＦＡ，ＰＢＳ洗Ｈ遍１５ｍｍ。弃掉，每遍在摇床上摇至（４）染色：用洗液稀释ＢＣＩＰ３００巧，用洗液稀释ＮＢＴ１５（ＸＸ，然后将稀释（（）后的ＢＣＩＰ和ＮＢＴ混合，加入ｉＰＳ细胞中。避光保存３０ｍｉｎ。（５）把染料弃掉，用ＰＢＳ洗两遍，然后在显微镜下观察。ｉＰＳ细胞克隆被ＡＰ染成深紫色为阳性，ＭＥＦ饲养层细胞和其它杂细胞被ＡＰ染成粉红色或不着色。２．２免疫巧光染色鉴定ＩＰＳ细胞特异性标记，应用人类ＥＳ／ｉＰＳ细胞表面标记物－－－－－＾８４２ＥＡ４ＥＡ１１鉴定抗体试剂盒，检测０ＣＴ，Ｓ０Ｘ、ＳＳ、％３、Ｔｍ６０、化ｎｏｇ、Ｔｒａ等基因。（），２４，１复苏Ｍ即细胞将其接种到孔板中第二円将待测的巧Ｓ细胞接种到ＭＥＦ饲养层细胞继续培养两天，ＰＢＳ。弃培养液液洗Ｈ遍。（２）固定ＩＰＳ细胞：加入２００山４％ＰＦＡ，室温放置２０ｍｉｎ，弃掉４％ＰＦＡ，ＰＢＳ洗Ｈ遍（３）通透：加入２００ｕｌ０．０５％ｔｒｉｔｏｎ，室温放置３０ｍｉｎ，弃掉ｔｒｉｔｏｎ，ＰＢＳ洗Ｈ遍（４）封闭：加入２％ＢＳＡ，室温放置比。弃掉２％ＢＳＡ，加新鲜２％ＢＳＡ２００ｕｌ’一一（５）染色：Ｗｌ：２００比例在各孔中加入抗，４Ｃ过夜。第二天弃掉抗，ＰＢ一Ｓ洗Ｈ遍，５ｍｎ２％ＢＳＡ，每遍放在摇床上ｉ。最后次清洗去除ＰＢＳ后加入２００山■ｌｕ—抗，室温避光放置化ｌ。（６）染核：ＲＮＡ酶１：１０００，０．５ｍｌＰＢＳ０．５ｕｌＰＩ，室温放賈ｌＯｍｉｎ，（７）封片：把圆形玻片放置载玻片上，用透明指甲油固定住。）（８在倒置巧光显微镜下观察染色结果。２．３Ｉｐｓ细胞的多能基因检测２．３．１细胞的ＲＮＡ提取：实验选择所诱导的ｉｐｓ细跑，人盼细胞及分化前的人包皮成纤维细胞，利用Ｔｒｉｚｏｌ分别提化细胞ＲＮＡ，步骤如下；（１）分别将ｉｓ细胞，人ＥＳ细胞及分化前的人包皮成纤维细胞消化富集，ｐ２７ 解放军医学院博＋学位论文用阳Ｓ洗两次；（２）弃去ＰＢＳ，加入１ｍＬ町ｉｚｏｌ，充分混匀后，置于冰上裂解日ｍｉｎ；？（３）２００ｉＬｍｎ加入ｌ氯仿，剧烈振荡１５ｓ，冰上放置２３ｉ，使其自然分层；°４４、１２１ｉ（）在Ｃ离屯机，应用０００ｒｐｍ离必５ｍｎ；一（５）小也吸取上清移入另个ＥＰ管中（约日５０ｕＬ），并保证不要吸到中间蛋白质层；（６）排管中加入等体（５５０ｉＬ１在新积的异丙醇ｌ）后震荡混匀，室温放置０ｍｉｎ使核酸沉淀完全；°（７）在４。１２０００巧１１１离必１０〇１１１１，弃去上清液，管底的沉淀为３難；（８）加入无ＲＮＡ酶水配制的７５％乙醇ＩｍＬ清洗沉淀，反复颠倒几次，使沉淀°悬起，然后４Ｃ７５００ｒｐｍ，离也５ｍｉｎ；（９）尽量弃干净上清，冰上自然瞭干巧ｍｉｎ左右，使沉淀透明。－－（１０）视沉淀倩况用２０５０ＵＬＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ，冰上溶解２０３０ｍｉｎ后，测ＲＮＡ浓度。２．３．２反转录（１）为防止ＤＮＡ对后续实验的干扰１ＤＮＡ消化酶对提取的，在反转录前用峭组织总ＲＮＡ进行ＤＮＡ消化处理，反应体系如下：ＲｅｇｅｎｔＶｏｌｕｍｅ（ｙＬ）＝－ＴｏｔａｌＲＮＡ（Ｕｇ１．０８．０）Ｒｎａ－ｆｒｅｅｔ－ｓｅｄｉｓｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ０．〇７．０ＲＱｌＤｎａｓｅｌＯＸＲＴＢｕｆｆｅｒ１．０ＲＱｌＤｎａｓｅ１．０ＴｏｔａｌＶｏｌｕｍｅ１０．０（２）在冰上加入体系内需要的试剂，３７ｒ反应３０ｍｉｎ，再加入１ｕＬＳｔｏｐ°＂Ｓｏｌｕｔｉｏｎ６５Ｃ反应１０ｍｉｎ，终止反应。（３）使用反转录试剂盒，切提取的总ＲＮＡ为模板，［：ＵＲａｎｄｏｍ化ｉｍｅｒ为引物进行反转录。反应如下：２８ 解放军控学院博＋学位论文ＲｅａｇｅｎｔＶｏｌｕｍｅ（ｕＬ）ＴｏｔａｌＲＮＡＩＬＯＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒ１．０Ｒｎａｓｅ－ｆｒｅｅｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ１．０°７０Ｃ日ｍｉｎ，立即放置冰上Ｍ－ＭＬＶ５ＸＲＴＢｕｆｆｅｒｉＴｏ２．５ＸｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ１．０ＲｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ１．０Ｍ－ＭＬＶ１．０ＴｏｔａｌＶｏｌｙｍｅ２０．０ＷＶ６０ｍｉｎ°７０ＣｌＯｍｉｎ２．３．３ＰＣＲ检测基因表化ＰＣＲ反应体系如下：ＲｅａｇｅｎｔＶｏｌｕｍｅ（Ｌ）ｃＤＫＡＬＯ－ＦＰｒｉｍｅｒ（１０ｕＭ）０．５Ｒ－Ｐｒｉｍｅｒ（ｌＯｙＭ）０．５２ＸＴａｑＰＣＲＭｉｘ１０．０Ｒｎａ－ｓｅｆｒｅｅｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ８．０ＴｏｔａｌＶｏｌｐｍｅ２０．０〇ＬＰＣＲ，ＰＣＲ，将Ｗ上反应成分加入．２ｍ反应管中放入仪进行反应反应条件如下：°９４Ｃ变性３ｍｉｎ°９４Ｃ变性３０ｓｅｃ＾’５５Ｃ退火３０ｓｅｃ扩増３０个循环—°７２Ｃ延伸３０ｓｅｃ°７２Ｃ延伸ｌＯｍｉｎ－°４ＣｌＯｍｉｎＷ上２９ 解放军医学院博±学位论文引物名称引物序歹Ｉｊ产物大小￣ｈＯｃ－ｔ４ＦＧＧＴＴＧＡＧＴＡＧＴＣＣＣＴＴＣＧＣＡ３９化ｐ￣－ＣＣＡＴＣＧＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＣｈＯｃｔ４Ｒ￣ｈＮａｎｏｇ－ＦＧＡＡＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣＣＧＧＴＣＡＡ２７３ｂｐ￣ｈＮａｎｏ－ＲＧＴＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＧＴＡＧＧＴＡＧＧｇ＇ｈＳｏｘ２－ＦａＡＣＣＡＧＣＧＣＡＴＧＧＡＣＡＧＴＴＡ２７化ｐ＾ｈＳｏｘ２－ＲＧＡＣＴＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＡＣＣＣＡＴ－ｈＲｅｘｌＦＣＴＣＣＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧＴＣＣＣＣＧ２２化ｐ－ｈＲｅｘｌＲＴＧＴＴＧＣＡＧＣＣＴＴＧＡＡＡＧＧＧＡ￣ｈＫ－ｌｆ４ＦＴＴＧＧＡＣＣＣＧＧＴＧＴＡＣＡＴＴＣＣ４８８ｂｐ＇ｈＫ－Ｒｌｆ４ＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＣＴＴＧＧＴＡＡＴＧＧ２８Ａ－ＦＡＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＧＡＡＣＣ２７化ｉｎ：化ｐ＇化－ＲｔＣＡＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＡＣｉｎ２８Ａ￣－ＦＧＣＡＣＡＴＴＡＧＡＣＣＡＴＧＣＧＡＧＣ３０化ｉｎ２８Ｂ化ｐ化－ｉｎ２８ＢＲＴＡＴＣＣＡＡＧＧＧＧＣＴＴＣＣＣＴＣＴ－ＦＣＡＴＧＡＧＡＡＧＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧａｐｄｈｌｌ＾ｐＧａｄｈ－ＲＡＧＴＣＣＴＴＣＣＡＣＧＡＴＡＣＣＡＡＡＧＴｐ２－．３．４应用２．５％琼脂糖凝胶电泳鉴定ＲＴＰＣＲ产物：（１）制备凝胶液：取２．５ｇ琼脂糖放入锥形瓶中，加人１００ｍｌ０．５Ｘ的ＴＢＥ缓‘冲液，，，应用微波炉加热至完全溶化取出摇匀室温下冷却至６０Ｃ，加入郎５０ｍｇ，混匀。（２）制备胶板：将胶版的有机玻璃内槽洗干净，嗦干。封好有机玻璃内槽边缘，不能留缝隙，槽内适当位貴放置样品梳子。当制备好的凝胶液缓慢将凝胶液倒入内槽胶厚度０－８ｃ．５０．ｍ左右，待凝胶冷却凝固后拔出样品梳子入电，凝，放泳槽中，电泳缓冲液应完全没过凝胶。（３）加样和电泳；ＤＬ２０００作为ＤＮＡ分子Ｍａｒｋｅｒ，用１ＸＴＡＥ电极缓冲液，取扩５ｉｌｙＬ上样缓冲液增产物溶液ｌＬ，加入，混匀，然后再用移液枪入加样孔中。接通电泳槽的电源巧始电泳，。并拍照记录结果在紫外凝胶成像仪上观察结果。２．４核型鉴定（１２３．５ｃｍ皿）准备的ｉＰＳ细胞量，个，选择长势最好的时候做核型此时中期细胞较多，基本是在传代后２天。（２）准备的试剂；ｄｅｍｉｃｏｉｎ（秋水仙素）°ｃｈｏｃ液：１２ｍｌｍｉｒｎＱ＋２ｍｌＦＢＳ＋１４山ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）３７Ｃ预热（）３０ 解放军腔学院博＋学位论文ｆｉｘａｔｉｖｅ：１５ｍｌ甲醇巧抽冰醋酸（冰上预冷）３２－３ｈ－化（）将生长中期的细胞加中期处理药物ｄｅｍｉｃｏｉｎ（１：２０００），处理。２之后用族酶将细胞消化成单个细胞，用成纤维细胞培养基终止，收集，吹打，离也１０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ。’°逐滴加入（４）弃上清，逐滴加入３７Ｃ预热好的油ＯＣ液体１ｍｌ，然后再ｃｈｏｃ‘８ｍｌ３７Ｃ脾育１５ｍｉｎ。液，（５）逐滴加入提前预冷好的ｆｉｘａｃｔｉｖｅｌｍｌ，混匀，室温温育５ｍｉｎ，ｌＯＯＯｒｐｍ，°ｌＯｍｉｎ。弃上清，逐滴加６ｍｌ的ｆｉｘａｃｔｉｖｅ。４Ｃ解育２０ｍｉｎ后离必ｌＯＯＯｒｐｍ，ｌＯｍｉｎ．（６）重复上述两步。一（７）此时要准备雾化的载玻片，直接把载玻片放在冰上，未接触冰的面准备滴细化。（８）化５－ｌａｃｔｅ最后离也后的细胞加ｍｌ的ｆｉｘｉｖ，把２００山的枪头的枪尖剪下，吸取１５山细胞悬液，滴片。一（９）自然干燥玻片，用Ｇｉｅｍｓａ液体染色７ｍｉｎ后，用流水冲洗未有细胞的Ａ＋Ｂ，ｍｌ染液。面，之后Ｍ干ｅｍｓａ液体：４５ｍｌ５。Ｇｉ（１０）风干后，观察照相。２．５类化体形成（邸）（１）选择状态较好的巧Ｓ来做ＥＢ一（２）把ｍｉＰＳ培养液弃掉，用ＰＢＳ洗下，加入适量０．０５％膜酶，放入培养ｌ－２ｍ箱ｉｎ。（３）镜下观察细胞变圆，克隆分散，变成单个细胞后，加入等量成纤维培养基进斤终止消化。（４）吹打，收集，离ｌＯＯＯｒｐｍ，３ｍｉｎ。（５）弃上清，直接用不加ｆ的小鼠诱导多能干细胞完全培养基悬浮，集中在ｌｉ培养皿中（６）放置在培养箱培养，第二天换液。培养四天左右。－－２．６崎胎瘤形成及应用苏木精伊红染色法ｍａｔｏｘｙｉｉｎｅｏｓｉｎｓｔａｉｎｉｎＨＥ）（胎ｇ，镜下观察崎胎瘤结构（１）准备３个六孔板的巧Ｓ细胞量。培养两天。３１ 解放军医学院博±学位论文ｐ一（２）把ｍｉｓ培养液弃掉，用ＰＢＳ洗下，加入适量化０５％膀酶，放入培养－２ｍ箱ｌｉｎ。（３）镜下观，察细胞变圆，克隆分散变成单个细胞后，加入等量成纤维培养基进行终止消化。（４）吹打，收集，离也，ｌＯＯＯｒｐｍ，３ｍｉｎ。（５）每个６孔板用３００ｕｌＰＢＳ悬浮。（６）然后去打ＳＣＩＤ鼠，选择小鼠大腿皮下注射，每只鼠打３００ｕｌ细胞，大概＾有１０６个细胞量。（７）饲养ＳＣ瓜鼠，大概４周左右就形成崎胎瘤，切除小鼠崎胎瘤组织。（８）鲜肿瘤组织块浸泡４％多聚甲醇溶液固定２４小时后行脱水处理。（９）脱水后应用石蜡包埋，切片（厚度５ｕｍ），切片先后应用二甲苯溶液及酒精溶液脱蜡后加３％Ｈ２０２甲醇溶液，室温下放置ｌＯｍｉｎ，应用蒸馈水漂洗Ｈ次，每次２ｍｉｎ。（１０）组织切片应用苏木素染色５ｍｉｎ，自来水冲洗后应用０．５％盐酸酒精分色３０秒，再应用伊红染色５ｍｉｎ、自来水冲洗。按顺序在８０％、９５％、１００％、１００％的乙醇中浸入３０秒、Ｉｍｉｎ、Ｉｍｉｎ、５ｍｉｎ序转入１００％二甲苯Ｉ３ｍｉｎ，二；然后顺甲苯ＩＩ５ｍｉｎ，二甲苯ＩＩＩ８ｍｉｎ。应用中性树胶封片，思微镜下观察细胞形态。二、结果１．ＡＰ染色不同的ＡＰ表达水平可Ｗ反映ＥＳ细胞的不同状态，未分化的ＥＳ细胞表达高水平的ＡＰ。ＩＰＳ与ＥＳ细胞有相似的特性，所Ｗ可Ｗ采用ＡＰ染色的方式来验证ｉｐｓＥＳ细胞是否具有类似细胞的全能性。本实验中，通过ＡＰ染色，可Ｗ发现ｉＰＳ细胞显示较高的碱性磯酸酶活性，与周围滋养层分界清晰，滋养层细胞无着色（图６），提示所诱导的ｉｐｓ细胞具有类似ＥＳ细胞的特性。——？＾‘，Ｉ＂．－．＇ＪＵＰｍｍ＾：．＇。＂：？＾，？＇ｙＣｆｌｒ．賴．；＂令難昌ｓｅｌｌ！繫瑪雜喔嚇喔圈６．ＩＰｓ细胞的ＡＰ染色ａ００Ｘ）３２ 解放军医学院博女学位论文２．免疫巧光染色与ＥＳ细胞类似ｉｓ，ｐ细胞也存在体细胞所不存在的特异性蛋白，如膜蛋白記ＥＡ－３－４ＴＲＡ－－－－、％ＥＡＬ６０、ＴＲＡ１８１，ｏ，Ｔ４、，质蛋白核蛋白Ｎａｎｇ转录因子０ＣＳ０Ｘ２等。本实验应用免疫炎光技术，在巧光显微镜下可见到所诱导的ｉｐｓ细胞表４－－－－－达０ＣＴ、Ｓ０Ｘ２、Ｎａｎｏ、％ＥＡ３Ｔ、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ＾６０、ＴＲＡ１８１均为阳性（图７）。ｇ提示ｉｐｓ细胞具有类似ＥＳ细胞的多能性。３－．ＲＴＰＣＲ检测ｉｐｓ细胞的多能基因应用Ｔｒｉｚｏｌ分别提取所诱导的ｉｐｓ细胞，人ＥＳ细胞及分化前的人包皮成纤Ｔ－ＰＣＲ０ＣＴ４维细胞的总ＲＮＡ，应用Ｒ的方法检测各种细胞中、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、Ｎａｎｏｇ、１？６义１、１２８３、１＾２８６、６３９化等基因表达量＾，结果经２．５％琼脂糖凝胶电泳分析（结果如图８）。可见在ｈＥＳ和ｈｉｐｓ细胞中，上述基因均有表达，而在Ｈ即细胞中，除化Ｆ４和Ｇａｐ加基因外，其他基因均不表达。特异标记分子细胞核ｍｅｒｒｅｇｈＥＳｈｉｓＨＦＦｐ〇ｃｔ４ＢＥＢｉＳｏｘ２Ｋｌｆ４－ｅｍＬｉｎ２８ａＬｉｎ２ＳｂＧａｄｈ■ＰＩ０□－８ＩＰｓＴＰＣＲ电泳图Ｂ图．细胞的多能基因检测Ｒ７（ｌＸ）图．ＩＰｓ细胞的免疫巧光染色ＯＯ３３ 解放军医学院博±学位论文４．核型分析ｉＧｉｅｍｓａ本实验中，选择长势最好的ｐｓ细胞，经秋水仙素等处理，滴片，液体染色风干后，在倒置显微镜下观察，采用Ｌｅｉｃａ分析处理后的染色体核型，发现具有正常的二倍体核型，４６条染色体、ＸＹ。（图９）。提示ＨＦＦ细胞诱导为ｉｐｓ细胞后，细胞核型保持正常。＾Ｈ＾１２３４５ＨＵＩＩｃｔＩｆＵＧ７０９１０１１１２ＩＩＩｔ詹着ＩＩＭ１４１７１３巧化１８Ｉ？？？？ｉＩＭ｛２１ＸＶ１９巧泣图９．ＩＰｓ细胞的核型分析图：４６条染色体，ＸＹ型５．类化体形成。巧Ｓ细胞去掉饲养层后在体外悬浮培养２天后，镜下可见到细胞聚集成球形、。边缘清晰，０），并且球形的体积随培养时间的延长而増大即形成了类胚体球（图１提示所诱导的ｉｐｓ细胞有多能分化潜能。图１化ＩＰｓ细胞体外分化为简单的类脏体口ＯＯＸ）３４ 解放军医学院博±学位论文６．畴胎瘤形成。体内分化畴胎瘤实验是判断所诱导的ｉｐｓ细胞具有多能性的重要证据。本实验中０６的ｉｓ３００ｕｌ）ＳＣ瓜鼠大腿皮下注射。１个月左右皮，取大约１ｐ细胞（约，在下注射部位形成包块，切除小鼠崎胎瘤组织，经石蜡包埋、切片，册染色后在倒置显微镜下观察，外，可见内胚层的肠上皮、腺体组织，中巧层的平滑肌组织胚层的神经管组织等（图１１，Ａ，Ｂ），证明所诱导的ｉＰＳ细胞具有分化为王胚层组织细胞的潜能。曲感图１１．ＩＰｓ细胞来源的崎胎瘤的ＨＥ染色组织切片（２００Ｘ）Ｈ、讨论，Ｓ诱导方法ｔ４在本实验中我们应用经典的ｉＰ，Ｗ逆转录病毒为载体将化，￥０ｘ２Ｋ－ｃｌｆ４和ｃＭｙ，ｈＥＳ，，因子导入人包皮成纤维细胞中应用细胞专用培养体系ＰＳ一培养病毒感染后体细胞，促使其诱导为ｉ细胞。在第部分的实验中，我们获ｉＰＳ得了可Ｗ集落性生长，可Ｗ无限增殖的类似ＥＳ的细胞克隆。为了验证所诱导的细胞是否具有类似ＥＳ细胞的全能性，我们采用了ＡＰ染色、免疫炎光染色，核型鉴定、类胚体形成、巧胎瘤形成等实验。ＡＰ是一种碱性磯酸酶，其表达，在正常的体细胞中不能表达或表达水平很低，４口水平可１＾１反映６５细胞的不同状态未分化的目５细胞表达高水平的，而４？表达ｔ？ＰＳ水平低或不表达提示盼已分化。Ｉ与ＥＳ细胞有相似的特性，所Ｗ可Ｗ采用ＡＰ染色的方式来验证ｉｐｓ细胞是否具有类似ＥＳ细胞的全能性。在我们的实验中，ｉｐｓ细胞的ＡＰ染色显示为阳性，而附近的饲养细胞显示ＡＰ染色为阴性。提示所诱３５ 解放军医学院博±学位论文导的ｉｐｓ细胞有类似ＥＳ细胞的ＡＰ阳性的特性。不同细胞可表达特异性的蛋白，ＥＳ细胞可Ｗ表达特异性的蛋白，如膜蛋白沾ＥＡ－－＾６０－１－１、ＳＳＥＡ３、％ＥＡ４，核蛋白化ｎｏｇ、质蛋白ＴＲＡ、ＴＲＡ８１等，人ＥＳ细胞与鼠ＥＳ细胞不同，可Ｗ表达ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４，是人ＥＳ细胞的特异性标志蛋白。ｉｐｓ细胞和ＥＳ细胞类似，也可Ｗ表达上述蛋白。人的化ｔ４蛋白是维持胚胎干细胞多潜能性最重要的关键基因，它在不同种系之间具有高度保守性即使重编程中Ｕ＂不可缺少的核也转录因子，也对维持细胞的全能性具有重要作用。Ｓｏｘ２的功能包括：１．参与巧胎的早期发育２．维持中枢神经系统干细胞的活性３．调节胃肠；；ｕｗｎ道基因的表达；同时在未分化的肿瘤中也发现有商度表达。在早期胚胎发育过—程中，Ｓｏｘ２的所具有的主要作用是与０ＣＴ４起构成０ＣＴ４／Ｓ０Ｘ２复合物，送种复合物可Ｗ协同或措抗０ＣＴ４的表达，在诱导ＩＰＳ过程中，Ｓ０Ｘ２的协同作用还表现与０Ｃ—－ＣＴ４－Ｔ４起，可Ｗ协同激活０ＣＴ４Ｓ０Ｘ２増强子，０Ｓ０Ｘ２増强子可Ｗ调节多能性相关基因ＮＡＮ０Ｇ、０ＣＴ４和Ｓ０Ｘ２的表达，从而使胚胎干细胞保持在未分化状态。因此Ｓ０Ｘ２也可Ｗ作为胚胎干细胞具有全能性标志物。我们通过相应蛋白特异性的抗体，应用免疫萊光染色技术，在所诱导的ｉｐｓ中发现０ＣＴ４、Ｓ０Ｘ２、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－－－－１６０、ＴＲＡ１８１等巧光染色呈阳性反应，，而周围的饲养层细胞染色阴性提－示所诱导的ｉｐｓ细胞也可Ｗ表达上述特异性蛋白，同时应用ＲＴＰＣＲ的方法发现在４Ｘ２－－４－－－１－ＥＳ细胞和所诱导的ｉｐｓ细胞中０ＣＴ、Ｓ０、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ、ＴＲＡ１Ｓ０、ＴＲＡ８１及化ｎｏｇ等基因均有表达，而在ＨＦＦ细胞中，除ＫＬＦ４和Ｇａｐ化基因外，其他基因均不表达。提示所诱导的ｉｐｓ细胞具有类似ＥＳ细胞的特性。成熟的分化细胞重编程为ｉｐｓ细胞，需要长期在体外培养，并且需要整合外，由于在体外长期培养及涉及加入多种转录因子源基因，要警惕起遗传特性会发生改变一，运就涉及到个生物安全性问题。核型分析是判断细胞在体外培养条件下是否已发生转化的可靠指标一。通过研究分裂中期染色体，按照定的特征排列细胞染色体的核型图象通过对所分析的染色体的特征，如染色体的数目、大小、，。长度及着丝点位置等进行分析，来判断染色体是否存在异常我们在实验中对所诱导的ｉｐｓ细胞进行了核型分析，结果显示所诱导的ｉｐｓ细胞具有４６条染色体，ＸＹ型，核型正常，提示有人包皮成纤维细胞所诱导的ｉｐｓ细胞核型正常。除了在分子水平对ｉｐｓ细胞的多能性进行了验证之外，我们还研究了ｉｐｓ的３６ 解放军區学院博＋学位论文多能分化潜能，送里主要采用的是类胚体实验和崎胎瘤实验，ｉＰＳ细胞去掉饲养层后在体外悬浮培养２天后，镜下可见到细胞聚集成球形、边缘清晰，并且球形的ｉ体积随培养时间的延长而增大，即形成了类胚体球，提示所诱导的ｐｓ细胞有多能分化潜能。在动物体内实验中，许多研究发现在免疫缺陷小鼠皮下植入ｉＰＳ细胞，其可Ｗ继续存活，并可在注射部位形成由胚胎发育的Ｈ个胚层组织细胞构成ｚｗｉｔｌ的崎胎瘤。有些研究还发现不同克隆的ｉｐｓ细胞注射入组织后还有不同的分ｔｗ化倾向，如有的倾向于分化为神经组织，有的倾向于分化为原始肠组织等。本６实验中，取大约１〇的ｉｐｓ细胞（约３００ｕ０，在ＳＣＩＤ鼠大腿皮下注射。１个月左右皮下注射部位形成包块，，肥，切除小鼠崎胎瘤姐织经石蜡包埋、切片染色后在倒置显微镜下观察，，可见内胚层的肠上皮、腺体组织，中胚层的平滑肌組织外化层的神经管组织等，证明所诱导的ｉＰＳ细胞具有分化为Ｈ化层组织细胞的潜能。通过上述实验，我们验证了所诱导的ｉＰＳ细胞具有类似ＥＳ细胞的全能性，为进一巧通过ｉＰＳ细胞诱导肝细胞的形成提供实验物质基础。四、小结对应用ＨＦＦ细胞所诱导的ｉＰＳ细胞进行了生物学鉴定，证实了其在形态学上ＥＳＥＳ类似细胞，碱性稱酸酶活性为阳性，免疫英光染色可表达类似细胞的特异ＲＴ－ＰＣＲ性蛋白质，检测可表达与ＥＳ类似的基因，，体外实验提示可分化为类化体注射ＳＣ阻鼠可形成崎胎瘤，提示已经成功诱导出了具有类似ＥＳ细胞作用的ｉｐｓ细胞，并且核型分析正常。３７ 解放军隆学院博＋学位论文第Ｈ部分ＩＰＳ细胞诱导为肝细胞样细胞引言。肝功能衰竭严重威胁着人类的健康，病死率高巧移植治疗是目前最理想的治疗肝衰竭的手段，但由于供体的短缺，无法进行普遍推广。人工肝支持系统可Ｗ暂时替代肝脏功能，帮助病人度过肝衰竭危险期等待肝细胞再生，或维持病人生存至得到合适的供体进行肝移植。Ｂ化是目前认为最理想的人工肝，但其发展受限于肝细胞来源问题。ＩＰＳ细胞研究的发展及其在细胞替代治疗中的临床应用前景？为ＢＡＬ提供了可能的折细胞来源２００９，ＳｏｎＡｃｔｉｖｉｎ。年ｇ等首次报道通过先后加入Ａ４ｆ化ｒｏｂｌａｓｔｔｈ扣ｃｔｏｒ４．ＦＧＦ４Ａ２ｂｏｎｅ，成纤维细胞生长因子（ｇｒｏｗ）和骨形成蛋（１１１〇１〇６１１６１：１〇ｒｏｔｅｉｎ２ｓ巧吕ｐ。ＢＭＰ２）等因子通过四个阶段从ｉｐ细胞中诱导出了类似＂＂＂＂肝细胞样的细胞Ｔａｋａｔａ２０１１入高剂量。等年报道通过两巧法，首先通过加的ＡｃｔｉｏｎＡ培养３ｄ，诱导ｉＰＳ细胞向内化层的发生转化，在得到的内胚层细胞中再加入肝细胞生长因子（ＨＧＦ），再培养５山通过两步法也可Ｗ获得肝细胞样细胞。＂５＂＂２０一１２年，Ｃｈｅｎ等艰道应用Ｈ步法来诱导ｉＰＳ细胞生成巧细胞样细胞，第步在培养的ｉｓ细胞培养基中加入ＡｃｔｉｖｉｎＡ、Ｗｎｔ３ａ和ＨＧＦ；第二步，应用肝定型培ｐ一养基进步培养细胞第三步，在ＩＭＤＭ培养基中培养，同时加入含有制瘤素Ｍ、地；塞米松及通用型培养基的混合培养基，实现了体外将ｉＰＳ细胞诱导为肝细胞样细＂＂，Ｈ步法，ＰＳ胞并且诱导效率明显提高。本实验中，我们采用从ｉ细胞成功诱一导出肝细胞样细胞，并经进步的检测，所诱导的肝细胞样细胞具有成熟肝细胞的功能。材料和方法１．实验材料：Ｉ１．实验细胞：ＩＰＳ细胞来源于上化实验由人包皮成纤维细胞所诱导。１．２主要试剂：＿试剂名称生产商？－？ＴｅＳＲＥ８培养基加拿大ｓｔｅｍｃｅｌｌ公司Ｄ－ＰＢＳ＋Ｍ＋（无Ｃａ２，ｇ２离子）美国Ｇ化ｃｏ公司３８ 解放军医学院博＋学位论文ＤＭＥＭ－Ｆ１２美国Ｇ化０公司ＣＭａｔｒｉｇｅｌ基质胶美国ＢＤ公司ＲＰＭＩ１６４０美国Ｇ化Ｃ０公司ＡｃｔｉｖｉｎＡ英国ａｂｅａｍ公司、化ｔ３ａ美国ＡＢＣＬＯＮＡＬ公司胶原酶ＩＶ美国ｓｉｇｍａ公司血清替代物化ＯＳＲ）美国Ｇ化Ｃ０公司非必需氨基酸州ＥＡＡ；Ｃ０）美国Ｇ化公司谷氨醜胺：ｋＧｌｕ化ＭＡＸ美国Ｇ化ＣＯ公司目琉基乙醇美国ｓ－ｉｍａＡｌｄｒｉｃｈ公司ｇ－二甲基亚讽（ＤＭＳ０）美国ｓｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ公司ＩＭＤＭ培养基美国Ｇ化ＣＯ公司Ｍｔａｔ抑癌蛋白；ＯｎｃｏｓｉｎＭ美国Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ公司肝细胞生长因子－（ＨＧＦ）美国ｓｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ公司Ｓｏｘｌ７ｓ－抗体美国ｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ公司ＨＮＦ４ａ美国Ｅｌｐｉｔｏｍｉｃｓ公司ＡＦＰ单克隆抗体美国ｓ－ｉｍａＡｌｄｒｉｃｈ公司ｇＤｏｎｋ巧ａｎｔｉｇｏａｔ／ｃｙ５美国Ｊａｃｋｓｏｎ公司Ｒａｂｂｔ－ｉｔａｎｉｍｏｕｓｅ／ＦＩＴＣ美国ｓｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ公司ＰＡＳｍａ－Ａ试剂盒美国ｓｉｇｌｄｒｉｃｈ公司１．３试剂配方；（ＩＲＰＭ＋（终浓度为ｎｍ＋Ｗｔ３ａ１）内胚层分化培养基；Ｉ１６４０ＡｃｔｉｖｉｎＡ１００ｇ／ｌ）ｎ（终浓度为５０ｎｇ／ｍｌ）。（２）内胜层分化培养基ＩＩ：ＲＰＭＩ１６４０＋Ｂ２７（ＩＸ）＋ＡｃｔｉｖｉｎＡ（终浓度为ｌＯＯｎｇ／ｍｌ）（３）肝分化培养基：ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２０％血清替代物＋非必需氨基酸（ｌｘ）＋谷氨醜＋＋胺（ｌｘ）目琉基乙醇（终浓度０．ＩｍＭ）ＤＭＳ０（１％）（４）肝成熟分化培养基：ＩＭＤＭ培养基＋巧癌蛋白Ｍ（终浓度３０ｎ／ｍｌ）＋肝细胞ｇ生长因子（终浓度５０ｎｇ／ｍｌ）＋地塞米松（终浓度ｌＯｕＭ）。３９ 解放军医学院博±学位论文１４．主要器材：名称厂家（３ｌ）ｕｎｃ细胞培养皿．５ｃｍ、６ｃｍ、Ｏｃｍ丹麦Ｎ公司细胞培养板（日孔、１２孔、２４孔、４８孔）丹麦Ｎｕｎｃ公司细胞培养瓶（Ｈ５）美国康宁公司离必管（２ｍｌ，５ｍｌ，１０ｍｌ，巧ｍｌ，５０ｍｌ）法国ＧＩＬＳＯＮ公司＂０．５／ｌ．５ｍ化Ｐ管美国Ａｘｙｇｅｎ公司滤膜（０．４日ｕｍ）美国ＭｉｌＨｐｏｒｅ公司５％Ｃ０２培养箱上海为康设备有限公司超净工作台苏州净化设备厂倒置镜德国Ｌｅｉｃａ公司－Ｍｉｆｌｉ６Ｋ微型离也机珠海黑马医学仪器公司ｓｉｇｍａ３Ｋ１８台式高速低温冷冻离也机德国ｓｉｇｍａ公司’ＰｎＥＴＭＡＮ⑨移液器法国ＧＩＬＳＯＮ公司移液枪法国ＧＩＬＳＯＮ公司２．实验：强２．１ｈｉＰＳ向巧细胞的分化２．１．１ＭＰＳ细胞准备一（１）提前天准各饲养层细胞。’一（２）从液氮中取管冻存细胞，立即放于３７Ｃ水浴锅中，摇晃，直至冰晶刚一一ｌ刚完全融化，５ｍ，。立即拿到超净台将冻存液移到１离也管中再滴滴的加入５ｍ－ｌＩＰＳ细胞培养基。离也，ｌＯＯＯｒｐｍ，３ｍｉｎ。弃上清，按照冻存比例ｌＸ６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ接种，［。隔日换液并每天观察细胞状态。待细胞长到可＾传代的状态（３）加入１ｍｌ浓度为Ｉｍｇ／ｍＬ的胶原酶ＩＶ，放入３７度的培养箱中腊育５ｍｉｎ，待克隆的边缘与饲养层分开并发亮并稍微卷起后可Ｗ进行中止；４一（）弃掉胶原酶ＩＶ后加入ＤＭＥＭ／Ｆ１２洗緣次，再加入ＤＭＥＭ／Ｆ１２，用枪头或者移液管将大克隆划成小克隆，收集到１５ｍＬ离也管中，８（Ｋ）ｒ／ｍｉｎ离也２ｍｉｎ；（５）弃掉上清，用Ｅ８培养基重悬，小必吹匀细胞悬液，并接种到提前铺有°Ｍａｔｒｉｇｅｌ基质（至少在３７Ｃ条件下３０ｍｉｎ）培养皿中；４０ 解放军轻学院博＋学位论文（６）待第二天细胞长至孔板的约８０％时开始分化，这是注意的是细胞克隆要一小，Ｗ避免分化不均。２１ｉＰ．．２ｈＳ细胞分化为内胚层细胞（１）吸掉ｈｉＰＳ细胞上清，用ＤＭＥＭ／Ｆ１２洗细胞后，换成内化层分化培养基Ｉ。一２一（）分化天后，能够看到克隆周边的细胞会分散开，并有定数量的细胞死ｔ：。（３）第二天，更换内化层分化培养基ＩＩ，并照相记录（４）第四天，内化层分化完成，采用核蛋白ＳＯＸ＾作为ｍａｒｋｅｒ，应用免疫巧光检测分化的效率；’①固定：取待检测的内胚层细胞，用４％多聚甲醒（ＰＦＡ）在４Ｃ固定过夜；－１ｉｎ②通透：用０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ００在室溫渗透３０ｍ；－ＢＳＡ：２％ＰＢＳ在室温封闭１个小时③封闭；°一－１％ＰＢＳＢＳＡＳｏｘｌ７１：２００）中，４Ｃ④抗解育：将囊化放入用稀释的抗体（一脾育过夜，同时设不加抗的阴性对照；Ｘ一日ＰＢＳ２１５ｍｉｎ将未结合的抗洗掉⑤次，将化胎用洗，；－２００二１％ＰＢＳＢＳＡ：），⑥抗將育：将囊化放入用稀释的二抗（１中室温解育１小时（避光）；用ＰＢＳ洗去未结合的二抗，室温放置２Ｘ巧ｍｉｎ（避光）；⑦核染色：用ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｌｏｄｉｄｅ（１０帖／ｍｌ）染核内ＤＭ，室温脾巧２０ｍｉｎ（避光）ＺｅｉｓｓＭｅｔａ５１０型激光共聚焦显微镜观察染色结果。；用（５）采用核蛋白Ｓ０Ｘ１７作为ｍａｒｋｅｒ，应用流式染色检测分化的效率阳Ｓ洗两次〇．巧％①消化。化出要进行染色的细胞，弃去培养液，用，并用膀蛋白酶消化２ｍｉｎ，待消化成单个细胞后用膀蛋白酶中止液中止消化。收集细胞、ｉ、悬液至１５ｍＬ离屯管，１０００ｒ／ｍｎ离屯３ｍｉｎ，弃上清。一ｒ／ｍ、②洗洛ＰＢＳ液遍，１０００ｉｎ离屯３ｍｉｎ，弃上清。。用洗－２７５ｍ③固定ＣＴＣ预冷的７０％酒精．ｍＬ，冰浴３０ｉｎ（可Ｗ过夜，第。缓慢加入二）天染色。ＤＰＢＳ１、ｌｉ，，（ＯＯＯｒ／ｍｉｎ３ｍｎ）弃上清液。④洗涂：用液洗遍室温离屯，⑤封闭：加入封闭液，室温艇育３０ｍｉｎ。一一抗反应：２００比⑥：按照１例用抗体稀释液稀释抗并加入适量的抗体。同４１ 解放军睦学院博＋学位论文一时准备管不加抗体的细胞作为对照。室温解育１ｈ。ＤＰＢＳ洗恣３次，１０００ｒ／ｍｉｎ＇。５ｍ离ｉｎ。二抗：二抗。加入稀⑦反应：按照１２００比例用抗体稀释液稀释英光标记的释ｉ日ｉ后的二抗，室湿脾育３０ｍｎ。ＤＰＢＳ洗涂３次，室温ｌＯＯＯｒ／ｍｉｎ离也每次ｍｎ。，用流式细胞仪分析细胞亚群⑨上机检测。先测对照管，调节电压确定阴性区，再测实验管。能与巧光标记抗体结合的细胞会发出相应的巧光，据此分选出阳性区间的细胞。２．１．３分化为巧前体细胞（１）前述的ｈｉＰＳ细胞培养第四天，更换为肝向分化培养基。细胞开始逐渐出一，并且数量有所增加现形态变化。每两天更换次培养基。（２）第十天，肝前体细胞分化完成，可Ｗ采用ＨＮＦ４ａ作为ｍａｒｋｅｒ应用免疫，巧光检测分化的效率。‘，４％ＦＡＣ固定过夜①固定：取待检测的肝前体细胞用多聚甲酵（Ｐ）在４；Ｔ－ｉ１②通透：用０．５％ｒｔｏｎＸ００在室温渗透３０ｍｉｎ；２％ＰＢＳ－ＢＳＡ１⑨封闭：在室温封闭个小时；’一－１ＰＢＳＢＳＡＨＮＦ４ａ４④抗脾育：将肝前体放入用％稀释的和抗体中，Ｃ脾育过夜一，同时设不加抗的阴性对照；ＰＢＳ２Ｘ一日１５ｍｉｎ，⑤次，将肝前体细胞用洗将未结合的抗洗掉；－⑧二抗赔育１％ＰＢＳＢＳＡ，：将肝前体细胞放入用稀释的二抗中室温赔育１小时（避光）；用阳Ｓ沈去未结合的二抗，室溫放置２Ｘ巧ｍｉｎ（避光）；門（ＰｒｏｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅ１０ｌＨｏｅｃｈｓｔ（ｌｕｇ／ｍｌ）⑦核染色：用ｐ（惦／ｍ）或染核内ＤＮＡ，室温脾育２０ｍｉｎ（避光）；用ＺｅｉｓｓＭｅｔａ日１０型激光共聚焦显微镜观察染色结果。（３）采用核蛋白ＨＮＦ４ａ作为ｍａｒｋｅｒ，应用流式染色检测分化的效率，，用ＰＢＳ洗两次①消化，并用０．巧％。取出要进行染色的细胞弃去培养液２ｍｉｎ膜蛋白酶消化，待消化成单个细胞后用族蛋白酶中止液中止消化。收集细胞悬液至１５ｍＬ离必管，１０００ｒ／ｍｉｎ离必３ｍｉｎ，弃上清。一ｉ②洗涂。用ＰＢＳ液洗遍，１０００ｒ／ｍｉｎ离也３ｍｎ，弃上清。’－７０２０Ｃ预冷的％酒精７，③固定。缓慢加入．５ｍＬ冰浴３０ｍｉｎ（可Ｗ过夜，第４２ 解放军医学院博＋学化论文二天染色）。④洗涂：用ＤＰＢＳ液洗１遍，室温离私（１０（Ｋ）ｒ／ｍｉｎ，３ｍｉｎ），弃上清液。⑤封闭：加入封闭液，室温解育３０ｍｉｎ。一一一抗反应：参考抗的说明书⑧，按照适当比例用抗体稀释液稀释抗并加一入适量的抗体。同时准备管不加抗体的细胞作为对照。室温解育Ｉｈ。Ｄ阳Ｓ洗冻３次，１０００ｒ／ｍｉｎ离也５ｍｉｎ。⑦二抗反应：参考二抗的说明书，按照适当比例用抗体稀释液稀释巧光标记３０ｍＤＰＢＳ３的二抗。加入稀释后的二抗，室温赔育ｉｎ。洗洛次，室溫ｌＯＯＯｒ／ｍｉｎ、每次ｎ离屯５ｍｉ。，用流式细胞仪分析细胞亚群，，⑨上机检测。先测对照管调节电压确定阴性区再测实验管，。能与巧光标记抗体结合的细胞会发出相应的巧光据此分选出阳性区间的细胞。２．１．４肝前体细胞的成熟（１）前述的ｈｉＰＳ细胞第十天，将培养基更换为肝成熟培养基一－２１８１９（）每两天更换次培养基，细胞开始逐渐变为典型的原代肝细胞形态。（３）采用ＡＦＰ作为ｍａｒｋｅｒ，应用免疫巧光检测肝组细胞ＡＦＰ的合成情况。’①固定：取待检测的细胞，用４％多聚甲醒（ＰＦＡ）在４Ｃ固定过夜；５ｔ－１②通透：用０．％ＴｒｉｏｎＸ００在室温渗透３０ｍｉｎ；－：２％ＰＢＳＢＳＡ在室温封闭１个小时③封闭；°一－（１：，４Ｃ④抗解育：将检测细胞放入用ＷＰＢＳＢＳＡ稀释的ＡＦＰ抗体５００）中一脾育过夜，同时设不加抗的阴性对照；一⑤次円，将检测细胞用Ｐ胎洗２Ｘ１５ｍｉｎ，将未结合的抗洗掉；－ＢＳＡ１２００二Ｒａｂｂ⑥二抗解育：将细胞放入用１％ＰＢＳ：稀释的抗ｉｔａｎｔｉｍｏｕｓｅＴＣ（）二Ｘ１ｍｎ／門中，室温脾育１小时避光ＰＢＳ２５ｉ；用洗去未结合的抗，室温放置（避光）；⑦核染色：用ＰＩ（ＰｒｏｐｉｄｉｕｍｌｏｄｉｄｅｄＯ／ｍｌ染核内ＤＮＡ，室溫解育２０ｍｉｎ雌）（避光）；用ＺｅｉｓｓＭｅｔａ５１０型激光共聚焦显微镜观察染色结果。２２ｓ．Ｉｐ细胞诱导肝细胞样细胞的验证４３ 解放军輕学院博＋学位论文２．２．１应用流式染色检测成熟肝细胞表达ＡＬＢ１（）消化。取出要进行染色的细胞，弃去培养液，用ＰＢＳ洗两次，并用０．巧％族蛋白酶消化２ｍｉｎ，待消化成单个细胞后用膜蛋白酶中止液中止消化。收集细胞５ｍＬ离也管，１０００ｒ／ｍｉｎ离必３ｍｉｎ，弃上清悬液至１。一（２）洗涂。用阳Ｓ液洗遍，１０００ｒ／ｍｉｎ离私３ｍｉｎ，弃上清。’－（３）固定。缓慢加入２０Ｃ预冷的７０％酒精７．５ｍＵ冰浴３０ｍｉｎ（可Ｗ过夜，第二天染色）。（４）洗擦；用ＤＰＢＳ液洗１遍，室温离也（ｌＯＯＯｒ／ｍｉｎ３ｍｉｎ），。，弃上清液巧）封闭：加入封闭液，室温赔育３０ｍｉｎ。—一一（６）抗反应：参考抗的说明书，按照适当比例用抗体稀释液稀释抗并一ｈ加入适量的抗体。ＤＰＢＳ。同时准备替不加抗体的细胞作为对照。室温脾巧１洗涂３次１０００ｒ／ｍｉｎ也５ｍｉｎ。，离（７）二抗反应：参考二抗的说明书，按照适当比例用抗体稀释液稀释巧光标记的二抗，３０ｍｉｎ。ＤＰＢＳ３，ＯＯＯｒ／ｍｉｎ。加入稀释后的二抗室温解育洗冻次室温ｌ离也每次５ｍｉｎ。（８）上机检，测，用流式细胞仪分析细胞亚群。先测对照管调节电压确定阴性区，再测实验管。能与巧光标记抗体结合的细胞会发出相应的巧光，据此分选出阳性区间的细胞。２．２．２Ｗｈｉｐｓ为对照，Ｅｌｉｓａ方法检测分化后成熟肝细胞的ＡＬＢ分泌量（１）将抗体标准品按下述表格稀释成所需要的浓度。Ｓｔａｎｄ祉ｄｎｍ－０＿ｉｇ／ｌＲＳＩＯ１１４（２２ｍｇ／ｍｌＡ化ｕｍｎ）ＳａｍｐｌｅＤｉｌｕ州ｔ￣Ｉｎｉｔｉａｌ１０，０００５｜４１１ｍｌ１４００１００山ｆｒｏｍｉｎｉｔｉａｌ２．４ｍｌ－１ｆｒｏｍｓｔｄ１５００＾１２２００５００Ｍ１３５－１ｔｄ２５００Ｐ－１１００００Ｍｆｒｏｍｓ４５０己００Ｍｌｆｒｏｍｓｔｄ３日００Ｍｌ５２已己００Ｊ－Ｉｌｆｒｏｍｓｔｄ４５００Ｍ１＂６１＾５５００Ｗｆｒｏｍｓｔｄ５５００Ｗ７６－．２５５００Ｗｆｒｏｍｓｔｄ６５００Ｐ１１０Ｂｌａｎｋ５００Ｗ４４ 解放军医学院博＋学位论文－巧ｔ（２）将９６孔板中的每个孔中加入１００４１经过稀释的抗体，在室温（２０）腊育１个小时后清洗立次。（３）每孔中加入２００ｕｌ的封闭液在室温下赔巧３０ｍｉｎ后清洗五次。（４）加入１００ｕｌ样品在在室温下赔育１个小时后清沈五次。巧）每孔中加入１００经稀释的辣根过氧化物酶检测抗体在在室温下脾育１个小时后清洗五次。（６）每孔中加入１０日ｕｌＴＭＢ底物溶液在室温下避光解育ＩＳｍｉｎ。（７）每孔中加入１００ｕｌ终止液终止反应。（８）读取４５０ｎｍ处吸光光度度值。－２ｓｅａ－ｍｅ．２．３Ｗ未诱导的ｉｐ细胞、正常肝细胞为对照，应用ＲＴＰＣＲ及ＲｌｔｉＰＣ民检测成熟肝细胞标志物的表达（１）细胞的ＲＮＡ提取：实验选择所诱导的肝细胞样细胞，正常的肝细胞，未诱导的ｉｐｓ细胞，利用Ｔｒｉｚｏｌ分别提取细胞ＲＮＡ，步骤如下；①分别将所诱导的肝细胞样细胞，正常的肝细胞，未诱导的ｉｐｓ细胞消化富集，用阳Ｓ洗两次；②弃去ＰＢＳ，加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ，充分混匀后，置于冰上裂解５ｍｉｎ；？③加入２００ｕＬ氯仿，剧烈振荡巧Ｓ，冰上放置２３ｍｉｎ，使其自然分层；④在４Ｃ离必机，应用１２０００ｒｐｍ离也１５ｍｉｎ；一⑤小如吸取上清移入另个ＥＰ管中（约５５０ＵＬ），并保证不要吸到中间蛋白质层；⑥在新ＥＰ管中加入等体积的异丙醇巧日日ｙＬ）后震荡混匀，室温放置１０ｍｉｎ使核酸沉淀完全；。＠在４（：，１２００化口１１离也１０〇１：１山弃去上清液，管底的沉淀为１＾歴；⑨加入无ＲＮＡ酶水配制的７５％乙醇ＩｍＬ清洗沉淀，反复颠倒几次，使沉淀悬‘４Ｃ巧ｉｎ起，然后００ｒｐｍ，离也５ｍ；１ｍｎ⑨尽量弃干净上清，冰上自然瞭干日ｉ左右，使沉淀透明。２０－５０ＬＤＥＰＣＲＮＡ２０－⑩视沉淀情况用Ｕ水溶解，冰上溶解３０ｍｉｎ后，测ＲＮＡ浓度。（２）反转录４５ 解放军隆学院博±学位论文ＤＮＡ／①为防止对后续实验的干扰，在反转录前用ＲＱ１ＤＮＶ消化酶对提化的组织总ＲＮＡ进行ＤＮＡ消化处理，反应体系如下；ＲｅａｇｅｎｔＶｏｌｕｍｅｕＬ（）ｔ＝－ＴｏａｌＲＮＡ（ｌｎｇ１．０８．０）－Ｒｎａｓｅｆｒｅｅｄｔｅｄｗａｔｅｒ－ｉｓｉｌｌ０．〇７．０ＲＱｌＤｎａｓｅｌＯＸＲＴＢｕｆｆｅｒ１．０ＲＱｌＤｎａｓｅ１．０ＴｏｔａｌＶｏｌｕｍｅ１０．０’，３７Ｃ反应３０ｍｉｎ②在冰上加入体系內需要的试剂，再加入１ｕＬＳｔｏｐ°Ｓｏｌｕｔｉｏｎ６５Ｃ反应１０ｍｉｎ，终止反应。ＲＮＡＲａｎｄｏｍＰｒ⑤使用反转录试剂含，ｈｍｅ，Ｗ提化的总为模板Ｗ为引物进行反转录。反应如下：ＲｅａｇｅｎｔＶｏｌｕｍｅ（ｕＬ）ＴｏｔａｌＲＮＡｕＴｏＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒ１．０Ｒｎａ－ｆｒｅｅｔｉｓｅｄｉｓｌｌｅｄ１．０ｗ过ｅｒｔ’７０Ｃ５ｍｉｎ，立即放置冰上Ｍ－ＭＬＶ５ＸＲＴＢｕｆｆｅｒＡＡ）２．閒ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ１．０ＲｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ１．０Ｍ－ＭＬＶ１．０ＴｏｔａｌＶｏｌｕｍｅ２０．０３ＴＶ６０ｍｉｎ°７０ＣｌＯｍｉｎ（３）ＰＣＲ检测基因表达，ＰＣＲ反应体系如下：ＲｅａｇｅｎｔＶｏｌｐｒａｅ（ｕＬ）ｃｍ＾４６ 解放军陰学院博＋学位论文Ｆ－Ｐｒｉｍｅｒ（５ｍＭ）０．３Ｒ－Ｐｒｒａｅｒｉ（５ｍＭ）０．３ｉＴａ０．２ｑｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）０．３ｌＯｘＰＣＲ缓沛液２．０４灭菌水化．ＴｏｔａｌＶｏｌｕｍｅ２０．０将Ｗ上反应成分加入０．２ｍＬＰＣＲ反应管中，放入ＰＣＲ仪进行反应，反应条件如下：°９４Ｃ变性３ｍｉｎ’９４Ｃ变性３０ｓｅｃ＾’５５Ｃ退火３０ｓｅｃ扩增３０个循环—°７２Ｃ延伸３０ｓｅｃ°７２Ｃ延伸ｌＯｍ－ｉｎ°４ＣｌＯｍｉｎ社￣￣＾基因引物序列ＨＮＦ４ａ上游引物：ＣＴＧＣＴＣＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＡＧＡＴＣＣＡＴＧ下游引物：ＡＴＣＡＴＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＣＴＧＣＡＷ上游引物ＡＧＡＡＣＣＴＧＴＣＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧ：下游引物；ＧＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＣｍ上游引物ＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＡＡＣＣ；ＡＧＣＡＧＴＣＡＧＣＣＡＴＴＴＣＡＣＣＡＴＡＧＧ下游引物：Ｃ？上游引物：ＴＣＧＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＣ下游引物：ＧＣＡＧＴＣＧＴＧＴＧＡＴＡＴＴＧＧＴＧＴＴＴＲ上游引物：ＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧ下游引物：ＡＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＧＴＡｍ上游引物：ＧＣＡＴＣＣＴＡＴＧＴＣＧＣＡＣＣＣＴＣＡＧＣＡＡＣＴＡＡＣＣＧＣＴＣＣ下游引物：Ｄｍ上游引物：ＡＧＧＡＴＴＣＡＧＡＡＣＴＡＴＴＣＧＧＴＣ下游引物；ＴＴＡＧＡＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＧＡＴＧＬＤＬＲ上游引物：ＣＡＧＡＡＣＡＧＧＣＴＴＣＧＧＡＣＡＣＴＴＡＧＡＧＡＴＴＧＧＴＧＧ下游引物：ＴＧＧＩ１（４）２５－ＰＣＲ．％琼脂糖凝胶电泳鉴定ＲＴ产物：①制备凝胶液：取２．５ｇ琼脂糖放入锥形瓶中，加人１００ｍｌ０．５Ｘ的ＴＢＥ缓冲液，４７ 解放军睦学院博±学位论文’应用微波炉加热至完全溶化，，ＥＢ取出摇匀，室溫下冷却至６０Ｃ加入５０ｍｇ，混匀。。②制备胶板：将胶版的有机玻璃内槽洗干净，瞭干封好有机玻璃内槽边缘，不能留缝隙，槽内适当位置放置样品梳子。当制备好的凝胶液缓慢将凝胶液倒入－内槽，凝胶厚度化５化８ｃｍ左右，，待凝胶冷却凝固后拔出样品梳子放入电泳槽中，电泳缓冲液应完全没过凝胶。③加样和电泳：化２０００作为ＤＮＡ分子Ｍａｒｋｅｒ，用１ＸＴＡＥ电极缓冲液，化扩増产物溶液日ｕＵ加入ｌｕＬ上样缓冲液，混匀，然后再用移液枪入加样孔中。接通电泳槽的电源开始电泳，在紫外凝胶成像仪上观察结果。并拍照记录结果。巧－－－）ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＢＲｅｅｎＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘＰｕｓ；应用ＳＹ虹ｌ试剂盒，巧１反应体系ＲｅａｇｅｎｔＶｏｌｕｍｅ（ｕＬ）ｃｍｉＴｏ－ＦＰｒｉｍｅｒ巧ｕＭ）１．０－巧ＲＰｒｉｍｅｒｕＭ）１．０ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（２ｘ）１２．５ｄ册〇２民己ＴｏｔａｌＶｏｌｙｍｅ巧．０’’°°ｌ７２反应条件设置为：９５Ｃｍｉｎ９５Ｃ３０ｓ，５５Ｃ３０ｓＣ３０ｓ（标准Ｈ步法扩增；，４０个循环），最后进行融解曲线的扩增。４ＰＡＳｉ－．染色检测诱导的肝细胞的糖原贬藏（应用化ｒｏｄｉｃＡｃｉｄＳｃｈｉｆｆ（ＰＡ巧Ｓｔａｉｎｉｎｇ试剂盒）。－（１）乙醇溶液在室温固定细胞ｉｎ应用福尔马林Ｉｍ；一（２）应用阳Ｓ清洗遍固定后的细胞上清液，弃ＰＡＳ５－（３）加入（３９１）溶液室温艇巧５ｍｉｎ画用ＰＢＳ清洗，弃上清；；’－（４）加入ＳｃｈｉｆｆＳ（３９５２）试剂，室温僻育１５ｍｉｎＰＢＳ日ｍｉｎ；应用清洗，弃上清。ｔｏｘ－巧）加入Ｈｅｍａｙｌｉｎ（ＧＨＳ３）溶液染色９０ｓ，应用ＰＢＳ清洗染色后的细胞４８ 解放军医学院博±学位论文－３０ｓ巧，显微镜下观察染色结果。—、结果１、Ｉｐｓ细胞诱导为肝细胞样细胞流程简图诱导性多能干细胞诱导为细胞样细胞進冊肝分画肝麵坛＿＿…‘‘，Ｗ的》２［〇帮．Ｉｐｓ细胞诱导为巧细胞样细胞的不同阶段的表现：在生长状态良好的ｉｐｓ细胞中－ａｃｔ（图１２）应ｉｎＡｎｔ３ａ内胚层培养基１１用含有ＡＵｉ和Ｗ，天后换用仅含有Ａｃｔ１－ｉｖｉｎＡ的内胚层培养基ＩＩ２ｂ，第四天后，内胚层可分化形成（图），这时更换为巧向分化培养基，细胞数量増加，并开始逐渐出现形态变化，约分化第十天左一２－Ｃ培养基右逐渐分化为肝前体细胞（图１），细胞进，，此后换用肝成熟步分化－１形态类似正常肝细胞，为成熟的肝细胞样细胞（图２ｄ）。巧导咨化巧干巧腹內胚层细胞圓圓巧前巧细化巧巧巧巧化图１２人诱导能性干细胞向巧成熟细胞分化不同分化阶段细跑形态ａ分化前的诱导多能性干细胞ｂ分化第６－７天的内胜层细胞Ｃ分化到第１－口天的巧前体细胞ｄ分化到第１９－２００１２０天的肝成熟细胞（标尺ｕｍ）４９ 解放军医学院博±学位论文３．Ｉｐｓ细胞诱导为肝细胞样细胞的不同阶段的免疫炎光检测。在ｉｐｓ细胞诱导为肝细胞样细胞的过程中，为保证各阶段诱导的正确性，应用特定的标记物来验证细胞诱导的阶段ｏｘ－。在内胚层培养阶段，选用了Ｓｌ７作为内胚层细胞（Ｄ４５）４ａ９－的标志物，ＨＮＦ作为肝前体细胞的（Ｄ１０）标志物和和ＡＦＰ作为成熟的肝祖细胞８－（Ｄ１１９）的标志物。结果显示均可见到特异表达的绿色巧光，提示诱导过程正确（图１３）。特异标记分子细胞核ｍｅｒｒｅｇＷＢＫＭ画国国ＨＨＨＨ图１２人诱导能性干细胞向肝成熟细胞分化的不同阶段细胞特异的标志标记免疫巧光染色的结果：Ａ．ＳＯＸ１７，Ｂ．ＨＮＦ４ａ，Ｃ．ＡＦＰ４．Ｉｐｓ细胞诱导为肝细胞样细胞的不同阶段的流式染色实验检测细胞分化效率。在ｉｐｓ细胞诱导为肝细胞样细胞的过程中，ｍ用流式细胞染色检测各阶段分化的效率〇ｘ－。在内胚层培养阶段，选用了Ｓｌ７作为内胚层细胞（Ｄ４５）的标志物，ＨＮＦ４ａ作为肝Ｄ９－－前体细胞的１０）ＡＬＢＤ１８１９）（标志物和和作为成熟的肝祖细胞（的标志物。结果显示各阶段均可见到较高的分化效率（图１３）。５０ 解放军医学院博±学位论文５．ｌｉｓａＢ分泌ＡＬＢ是Ｅ方法检测分化后成熟肝细胞的ＡＬ量：分泌成熟肝细胞Ｅｌｉｓａ特有的功能，通过方法检测诱导后的肝细胞样细胞的ＡＬＢ分泌量，并与诱导前的ｉｐｓ细胞进行比较，发现诱导后的肝细胞样细胞的ＡＬＢ分泌量明显增离，提示己成功诱导出有功能性的肝细胞１４）。（图兄１１１ＩＮＫＮＣ换ＷＷＰＳｓｏｎ；ＨＮＮ．图１３不同时期流式的数据图１４人诱导能性干细胞向巧成熟细胞分泌的ＡＬＢ的测定６－Ｒｅａ－ｔＰＣＲ．肝细胞特异表达的基因的ＲＴＰＣＲ及ｌｉｍｅ检测：成熟的肝细胞可一、Ｗ表达些特定的标志物，４ａ、ＬＤＬＲ，是成熟巧细胞的标志本试验中选择了ＨＮＦＡＬＢ、ＣＫ１８、ＴＴＲ、ＴＡＴ、ＤＰＰ４、Ａ印作为特异性的标志物，！＾成熟肝细胞、未诱导ｓ－Ｐ－ｔｍｅＰＣＲ检的ｉｐ细胞为对照，提取细胞的总ＲＮＡ行ＲＴＣＲ及Ｒｅａｌｉ测，结果发现所诱导的巧细胞样细胞和成熟巧细胞类似，均可Ｗ表达上述基因，而未诱导的ｉｐｓ细胞无上述基因的表达，提示成功的诱导出了肝细胞样细胞（图巧）。ＳＳ］ＬｒａｉＰＳ５Ｓ．＾２０００＾Ｈ护Ｓ－ＩＩＩＡＩｄｅｒｖｔｏｃｔｅ．Ｈ巧ｉｅｄｈｅｐａｙｉ－ｉＲｎｍＡＨＩｎｉｉｆｌＨＩｆｌｉＨ１０００ＱＱｈｅｐａｔｏｃｙｔｅＩＩＩＩＩ１１ＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩｊｊｊｊｙｉｊｊｌｌ－图１５肝细胞特异表达的基因的ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ检测结果．ＰＡＳ染色检测诱导的肝细胞的糖原胆藏ｓ７：为验证ｉｐ细胞所诱导的肝细胞样５１ 解放军医学院博女学位论文细胞是否具有糖原胆存功能，通过对分化成熟的肝细胞样细胞行ＰＡＳ染色，结果可见ＰＡＳ染色阳性，提示所诱导的肝细胞样细胞具有糖原贬存功能（图化）。＇茲贼管曲辨來确ｗｍＭ图１６ＰＡＳ染色检测诱导的斤细胞的搪原胆藏结果左１００Ｘ，右２００Ｘ王、讨论。肝功能衰竭严重威胁着人类的健康，病死率高肝移植治疗是目前最理想的治疗肝衰竭的手段，但由于供体的短缺，无法进行普遍推广。人工肝支持系统可Ｊ＾，＜暂时，或维持病人ｔ替代肝脏功能帮助病人度过肝衰竭危险期等侍肝细胞再生．生存至得到合适的供体进行肝移植ＡＬ。Ｂ是目前认为最理想的人工肝，但其发展受限于肝细胞来源问题。关于人类化胎干细胞化ＥＳＣｓ）的研究曾是使人们对ＥＳ细胞应用于细胞治疗产生极大的兴趣。然而，由于ＥＳ细胞的巨大的増殖和分化潜能和ＥＳ可能的致癌性很难控制，尤其是所涉及到伦理问题，所Ｗ细胞的临床应用受到很大的限制。ＩＰＳ细胞由于具有类似ＥＳ细胞的多潜能性，同时又避免了伦理方面的ＭＬ提供了可能的肝细胞。争议，其在细胞替代治疗中的临床应用前景，为来源７＂６’３３近年来，多项在人和动物的实验中己经证实ｉＰＳＣｓ可Ｗ分化为肝细胞。ｉＰＳ细胞直接分化为肝细胞的策略为序贯联合应用一些参与哺現动物的肝脏胚胎发育ＢＷ的细胞因子和生长因子。从ｉＰＳ细胞诱导肝细胞产生的培养方法是在无血清培养基中添加必要的生长因子和刺激因子模拟原始巧细胞生长的环境，进而促进巧细ｎｗ胞生成，最后加入地塞米松和ＩＴＳ可Ｗ维持体外巧细胞的功能。从之前的实验中我们己经发现，ｉｓ细胞有转化为多种胚层细胞的潜能性ｐ。由于肝脏是有胚胎发育过程中的内胚层细胞发育而来的，所Ｗ在ＩＰＳ细胞诱导为肝细胞样细胞过程中，首５２ 解放军医学院博＋学位论文先ｉｐｓ细胞要诱导为内胚层细胞ＡｃｔｉｖｉｎＡＴ排ｅ超家族的成员，是细。为化长因子，在哺现动物内化殿诱导方晒起重要作用胞表面跨膜受体的激动剂。目前有关从ｉｐｓ诱导为肝细胞的研究中，多数都选用ＡｃｔｉｖｉｎＡ作为内胚层的诱导剂。有研究＂Ｗ发现，Ｗｎｔ家族，尤其是其成员Ｗｎｔ３ａ直接参与内胚层形成的调节，并且在肝脏发育的各个阶段都有Ｗｎｔ３ａ的表达，肝细胞再生的过程中也会诱导Ｗｎｔ３ａ的表达因此，Ｓｕｌｌｉｖａｎ等在诱导肝细胞的首阶段合用ＡｃｔｉｖｉｎＡ与Ｗｎ口ａ，快速有效地将ｉｐｓ细胞诱导分化为肝细胞样细胞。肝细胞生长因子（册巧对肝脏的发生非常重要。既往研究发现ＨＧＦ缺失小鼠不能生长出完整的肝脏结构，在小鼠模型的肝脏结ｗ＂一－，构的松散和实质细胞解离？ＨＧＦ和它的受体ＣＭＥＴ也参与些与细胞増殖，生存＂＂，运动，侵袭，和形态相关的重要功能。除了它的病理生理功能肝细胞生长因一子已被证明通过上调Ｓｎａｉｌ的表达诱导上皮细胞播散作为个ＷＥ巧粘蛋白为＂Ｗ＂５１加ｅｎ等ＨＧＦ，有效的提高的ｉ视向的转录抑制蛋白。通过在诱导过程中多加ｐｓ细胞诱导巧细胞的效率。。在肝脏胚胎发育的不同阶段，肝细胞可Ｗ表达不同的特异性标志物为监测ｉｓ细胞是否成功的定向分化为肝细胞样细胞，就需要监测不同阶段细胞所表达的ｐ，特定的标志物。但是，如何鉴定ｉｒｅ细胞衍生的类似肝细胞样细胞系目前并没有一、ＲＮＡ、统的标准。通常，类似肝细胞样细胞可Ｗ通过其形态肝脏特异的ｍ蛋白Ｗ一标志物、分化的每阶段特异性的标志物的功能性的表现来识别。通常应用ＨＮＦ３ｂＡＦＰ和转甲状腺素蛋白打ＴＲ的表达来鉴定衍生的原代肝细胞。肝细胞生成，）的中间阶段用肝细胞核因子ｌａ化ＮＦｌａ４ａＨＮＦ４ａ），白蛋白和），肝细胞核因子（细胞角蛋白１８ＣＫ１８），最后，成熟肝细胞通过色氨酸氧化酶（ＴＯ），酪氨酸（来鉴定ＴＡＴＣＣＡＡＴ／ａＣ／ＥＢＰａ特异的细胞色素Ｐ４５０氨基转移酶ｔ（），增强子结合蛋白（），＂＂’Ｗ超家族（ＣＹＰｓ无唾液酸糖蛋白受体１（ＡＧＰＲ１）等标志物。），和来鉴定，ｓ在本实验中，为将ｉｐｓ细胞诱导为肝细胞样细胞首先应诱导ｉｐ细胞向内胚一ＡｃＷｎｔ３ａ层分化，在送过程中，我们首先应用含有ｔｉｖｉｎＡ和的内化层培养基，当培养４天后，细胞出现了内化层细胞的形态学改变。我们选用了Ｓ０Ｘ１７作为脏测一内化层分化的标志物Ｓｏｘｌ７是内，。胜层分化早期的个重要的转录因子在内胚层ＰＷｌｏｘｌ７的分化中具有重要作用，Ｓｏｘ７基因的缺失可Ｗ中断胚胎的发育，通过对Ｓ，发现ｓ。斤免疫巧光染色及流式细胞染色检验ｉｐ细胞已向内胚层分化然后换用肝５３ 解放军医学院博±学位论丈向分化培养基，发现细胞数量增加，并开始逐渐出现形态变化，约分化第十天左ａ右逐渐分化为肝前体细胞，这时选用ＨＮＦ４作为标志物行免疫巧光染色及流式细胞染色检验。免疫巧光染色得到了明显的绿色炎光，流式细胞染色检验提示阳性一率为４４，，Ａ昨．４％。此后换用肝成熟培养基，细胞进步分化形态类似正常肝细胞一免疫巧光染色阳性。进步应用Ｅｌｉｓａ方法检测化Ｂ的分泌量，ＰＡＳ染色检测糖原胆－存功能－ｌｔｍｅＰＣＲ检，ＲＴＰＣＲ及Ｒｅａｉ测特异性基因的表达，均获得了阳性的结果，提示所诱导的肝细胞样细胞具有成熟肝细胞的功能一。为进步实现所诱导的肝细胞应用与生物人工肝，进而临床应用与肝衰竭病人提供了实验基础。四、小结前述实验中所获得的ｉｓ细胞经诱导成功分化为了肝细胞样细胞ｐ。诱导过程中各阶段的标志物经免疫巧光染色及流式染色验证正确，分化效率高。获得的肝细ＥＰＡＳ－胞样细胞经ｌｉｓａ方法检测ＡＬＢ的分泌量，染色检测糖原胆存功能，ＲＴＰＣＲＲｅａ－及ｌｔｉｍｅＰＣＲ检测特异性基因的表达，提示成功诱导出了具有成熟肝细胞的功能的肝细胞样细胞。５４ 解放军控学院博＋学位论文第四部分Ｉｐｓ细胞对小鼠肝损伤恢复的巧响的初步研究引言各种原因引起的急性肝功能损伤及巧功能衰竭严重危害我国人民的健康，常常危及病人的生命，，。对于终末期肝病肝脏移植是最有效的治疗手段但由于供体的缺乏，无法获得广泛的应用。近年来，国内外的多项研究发现，干细胞治疗，包括化胎干细胞、骨髓间充质干细胞、化带血干细胞等可用于急性肝损伤及肝衰一竭病人，并取得了定的疗效，可Ｗ作为细胞替代治疗的来源。这些干细胞的共同特点是可Ｗ自我更新，在体内具有向肝细胞分化的潜能。Ｉｐｓ细胞具有类似化胎干细胞的特性，可Ｗ自我更新，自主增殖、自我分化的多能性，同时也可Ｗ避免脏胎干细胞临床应用所必须面对的伦理问题，理论上也可Ｗ应用于肝功能损伤及肝功能衰竭的治疗。基于此，我们选择Ｃ５７小鼠，制造小鼠肝损伤模型，通过在Ｃ５７小鼠尾静脉注射ｉｐｓ细胞，了解ｉｐｓ细胞对肝细胞损伤是巧具有治疗作用。一、材料和方法１实验材料１．１实验动物和细胞Ｃ５７小鼠来源于斯贝福实验动物公司，ｉｐｓ细胞来源于前述实验。１．２主要试剂：试剂名称生产商０．０５％族酶思赛因公司注射用氨基半現糖美国ｉｎａｌｃｏ公词巧光染料ＣＦＳＥＲ本ＤＯｊｉｎＤＯ公司人ｉＰＳ细胞完全培养基（含血清）思赛因公司０．９％生理盐水石家庄第四制药厂ＰＢＳ美国Ｇ化ｅｏ公司１．３主要器材；５５ 解放军医学院博＋学位论文名称＾离也管（ｌＯｍｌ）思赛因公司０．５／１．５ｍｌＥＰ管美国Ａｘｙｇｅｎ公司５％Ｃ０２培养箱上海力康设备有限公司超净工作台苏州净化设备厂倒置镜德国Ｌｅｉｃａ公司体视镜德国Ｌｅｉｃａ公司Ｍｆ－ｉｌｉ６Ｋ微型离必机珠海黑马医学仪器公司’ＰｎＥＴＭＡＮ⑨移液器法国ＧＩＬＳＯＮ公司移液枪法国ＧＩＬＳＯＮ公司２．实验２．１Ｉｐｓ细胞复苏扩增：一（１）提前天准备饲养层细胞。°一（２）从液氮中取管冻存细胞，立即放于３７Ｃ水浴锅中，摇晃，直至冰晶刚＾一、，１１刚完令融化。立即拿到超净台将冻存液移到５１１１离屯管中，再滴滴的加入ＩＰＳ－５ｍｌ细胞培养基１０００巧１１１３ｍｉｎ。６ｗｅｌｌｌａｔｅ。离心，弃上清，按照冻存比例１Ｘｐ接种。隔日换液，并每天观察细胞状态。待细胞长到可Ｗ传代的状态（３）加入１ｍｌ浓度为Ｉｍｇ／ｍＬ的胶原酶ＩＶ，放入３７度的培养箱中赔育日ｍｉｎ，待克隆的边缘与饲养层分开并发亮并稍微卷起后可Ｗ进行中止；（４）吹打，收集，离必，１０００巧ｍ，３ｍｉｎ。弃上清，按照１：３左右密度接种在已经换好液的饲养层上。２．２Ｃ５７小鼠扣损伤模型：（１）预实验：７７ｉ取只巧小鼠，腹腔内分别注射氨基半乳糖（ｎａｌｃｏ）生理盐水注射液５００ｍｋｌ１５００ｍｋｇ２０００ｍｍｋｍｋ；５００ｍｋｇ／ｇ、ＯＯＯｍｇ／ｋｇ、ｇ／、ｇ／ｋｇ、巧ＯＯｇ／ｇ、３０００ｇ／ｇ、３ｇ／ｇ。１天后取眼眶血行生化检查，取肝脏行肝脏石蜡切片，肥染色行病理检查。（２）动物实验分組：雄性Ｃ５７小鼠２４化分Ｈ组，１组：６只，健康对照。２组：８，３组１０只实验组：只实验对照。一（３）造模：根据上步实验，腹腔内注射巧ＯＯｍｇ／ｋｇ氨基半乳糖可获得良好的５６ 解放军医学院博±学位论文（肝损伤模型。取巧只小鼠，腹腔内注射氨基半乳糖巧ＯＯｍｇ／咕氨基半乳糖工作液浓度为ｌＯＯｍｍｌ巧０山左右），并随机分为２姐：实验组巧只）ｇ／，腹腔注射约，实验对照组（１０只）。剩余６只小鼠腹腔注射生理盐水作为健康对照。２．３Ｉｐｓ细胞注射肝损伤Ｃ５７小鼠：２．３．ｌｉｐｓ细胞ＣＦ沈英光染ｋ：７ＰＢＳ－（１）准备ｉｐｓ细胞悬液，用（）等合适的培养基，调整细胞浓度至约１〇个／ｍｌ。（２）取１ｍｌ细胞悬液至试管中，加入适量ＣＦＳＥ工作液（终浓度日ｕＭ），轻轻揽拌混匀。’３３７Ｃ培养箱中培养－（）在１５３０ｍｉｎ。一、（４）离也后去上清，加入２ｍｌＰＢＳ溶液，再离屯后去上清，重复此操作次。（５）加入０．９％氯化钢溶液制成细胞悬液。７２．３．２造模２天后在实验组小鼠尾静脉注射ＣＦ沈英光标记后的ｉｐｓ细胞（ｌ〇／ｍｌ）２００ｕｌ。实验对照组尾静脉注射生理盐水。健康组、实验对照组各取两只老鼠，取巧脏标本，分别行石蜡切片行肥染色，取血行生化检查。义３．３注射细胞５天左右，实验组、实验对照组各取两只老鼠，取肝脏标本，分别行冰冻切片显微镜观察巧光，石蜡切片行肥染色，取血行生化检查（ＡＬＴ、ＡＳ。。２４１（ＡＬＴ、．３．注射细胞０天左右，实验组、实验对照组各取两只老鼠取血行生化检查ＡＳＴ、ＴＢＩＬ、ＤＢＩＬ），取巧脏标本分别行冰冻切片显微镜观察巧光，石蜡切片行肥染色。２．３．５巧天左右，实验组、实验对照组各取两只老鼠取血行生化检查（ＡＬＴ＇ＡＳＴ），取肝脏标本分别行冰冻切片显微镜观察巧光，石蜡切片行肥染色ＬＴＡＳＴ２．３．６２０巧右，实验组、实验对照组各取两只老鼠取血行生化检查（Ａ、），取肝脏标本分别行冰冻切片虽微镜观察巧光，石蜡切片行皿染色。二、结果１１．腹腔内注射氨基半乳糖后的Ｃ５７小鼠肝脏大体标本，如图６所示，１为正常２－８ＯｍＫ小鼠肝脏，为分别注射氨基半乳糖則ｇ／ｇ、ｌＯＯＯｍｇ／ｋｇ、巧ＯＯｍｇ／ｋｇ、２０００ｍ／ｋｇ、２５００ｍｋ、３０００ｍ／ｋ、３５００ｍｋｇ，１天后的取小鼠肝脏观察肝脏的ｇｇ／ｇｇｇｇ／大体表现。可见随着应用半现糖的量的增加，肝脏的形态及颜色均有明显改变。应用＞＾００ｍｇ／Ｋｇ氨基酸半乳糖注射Ｃ５７小鼠１天后，肝脏大体标本颜色较正常肝５７ 解放军医学院博±学位论文脏己明显改变，颜色已失去鲜红色，转为灰白色，并可见肝脏表面有大量点状坏死灶，提示肝脏损害明显。取小鼠血清在自动生化仪行肝功能分析，可见氨基半乳糖用量在＞＾〇〇ｍｇ／Ｋｇ时，小鼠血清的ＡＬＴ、ＡＳＴ明显升高，与大体组织病理所一见的标本表现致，选择Ｃ５７小鼠腹腔内注射巧ＯＯｍｇ／Ｋｇ氨基半郭糖作为肝损伤模型（图１７）。每急嗦Ａ參側＃７．＾．ｉ乐＇．．１襄．ｊ带ｒ巧．竭喊驛：職图１６，小鼠肝脏及渡腔内注射気基半乳籍后的肝脏大体标本。１？，２．５００ｍＫ、３．ｌＯＯＯｍｋ、４？巧ＯＯｍｋ日．２０００ｍｋ正常ｇ／ｇｇ／ｇｇ／ｇ、ｇ／ｇ、６．２５００ｍｇ／ｋｇ、７．３０００ｍｇ／ｋｇ、８．３５００ｍｇ／ｋ呂０１Ｉ…１■■巧０ｍ＂１■＾ｐ０—３００＋巧—００．誦网＾５００１１０００。－．５。‘Ｉ睡度词化這沼段进＾租七古：姐礙０１２３４５６７８图口一，不同浓度的氨基酸半乳糖注射小鼠腹腔天后小扇血清肝功指标。１．．？正常，２５００ｍｇ／Ｋｇ、３ｌＯＯＯｍｇ／ｋｇ、４．１５００ｍｇ／ｋｇ５．２０００ｍｇ／ｋ、ｇ、６．２５００ｍ、７ｍ；ｉｎｇ／ｋｇ．３０００ｇ／ｋｇ、８．３５００ｇ／ｋｇ５８ 解放军医学院博±学位论文２．Ｉｐｓ细胞的ＣＦ沈巧光染色；巧光染料ＣＦＳＥ可Ｗ结合细胞内的蛋白质，显示为、。绿色巧光，进入细胞后定位于细胞膜细胞质和细胞核，在细胞核的巧光最强本实验中，ｉｐｓ消化后，呈悬浮细胞状态，经印ＥＳ染色，在炎光显微镜下可见到绿色巧光（如图１８）。髮纖謂—齡著抱．品篇詞图１８ｉｐｓ细胞经ＣＦＳＥ染色巧光显微镜观察结果（Ｘ１００）ＡＢ：白光：绿色５巧光３．冰冻切片观察注射ｉｐｓ细胞后在小鼠肝脏的定植情况。应用ＣＦ沈巧光染色的一ｉｓＣ５７日，，ｐ细胞经尾静脉注射巧损伤的小鼠天后，小鼠仍存活般情况良好取肝脏行冰冻切片检查ｉｓ，可见小鼠巧脏内可见散在的绿色巧光，提示有标记的ｐ，细胞定植，随着细胞的分裂，ＣＦＳＥ巧光会减弱镜下可见部分细胞的巧光较弱，提示可能存在ｉｐｓ细胞在小鼠肝脏内分化（如图１９）。１０天后小鼠肝脏标本冰冻切片炎光显微镜观察未见明显的巧光，可能随着细胞的分裂増殖，子代的巧光逐渐减弱，已不能被观察到。图１９肝损伤Ｃ５７小鼠注射ｉｐｓ细胞５天后肝脏冰冻切片染色巧光显微镜观察结果（Ｘ２００）５９ 解放军医学院博±学位论文４．小鼠肝脏生化功能改变情况。肝损伤模型的Ｃ５７小鼠在注射ｉｐｓ细胞治疗后，血清ＡＬＴ、Ａ巧指标均逐渐恢复ｉｓ与未注射细胞的小鼠比较，，但注射ｐ细胞的小ＡＬＴ、ＡＳＴ２０）鼠指标恢复明显（如图。１４００Ｉ１２００１１岭ＨＩ腸＂ｚ；；；；岭＇｝侧￣＾ｖＶ１＼１＼Ｉ－—＾邸ｉａｊ￣￣＼￣＼Ｂ呼ｒ柳一￣＂＾ｈ．Ｌ＿Ｚ：ｉ＿．＾０１２３４５１２３４５图２０，不同时间肝损伤Ｃ５７小鼠血清ＡＬＴ、ＡＳＴ指标图。１．．造模后２天，２注射ｉｓ细胞５、３．注射ｉｓ细胞１０４．ｐ天ｐ天，注射ｉｐｓ细胞巧天，５．注射ｉｐｓ细胞２０天５．肝损伤小鼠注射ｉｐｓ细胞后不同阶段的组织病理学改变。与正常肝组织对照，Ｃ５７小鼠腹腔注射巧ＯＯｍｇ／Ｋｇ氨基半乳糖２天后，组织病理可见较多肝细胞水肿呈，２１气球样变，汇管区可见炎细胞浸润，并可见少数点状坏死灶、调亡小体等（图）。Ｉｐｓ细胞注射肝损伤小鼠２０天后，与未注射ｉｐｓ细胞小鼠比较，两者肝脏病理损害都有所改善，但注射ｉｐｓ细胞的小鼠肝脏病变改善明显，己接近正常小鼠肝脏。未注射ｉｐｓ细胞的小鼠肝脏仍可见炎症及巧细胞水肿，但未见明显坏死灶（图２２）。除變謁防普霸捂汽魏劍懿银纖瑪熟？師滯鱗肖棘；齡敏Ｉ纖．亦镜？杉冷巧論说：终巧《壤隊攤教输鱗痴岡隊鑛鑛窠縣麵６１＾辨調图２１，正常小鼠斤脏与肝损伤模型小鼠巧赃病理图（皿，２００Ｘ）左：正常肝组织，右肝损伤模型小鼠６０ 解放军医学院博＋学位论文覇圆錢＊１Ｂ讓瞧图２２，Ｉｐｓ细胞注射肝损伤小鼠２０天后（皿，２００Ｘ）左，；未注射ｉｐｓ细胞小鼠右：注姑ｉｐｓ细胞小鼠兰、讨论干细胞在细胞替代治疗的重要性主要体现在其可Ｗ分化为特定的体细胞，可。移植到体内，起到细胞替代的作用于此同时，干细胞移植还可Ｗ促进宿主细胞内特定的细胞的再生。众所周知，异体细胞的移植可能会带来移植后的排斥反。应，干机体的免疫排，但从目前的研究来看细胞的移植所产生的排斥反应很少一斥反应的启动，，需要系列细胞表面分子的共同参与如协同共刺激分子、细胞表面黏附分子、主要组织相容性复合体（ＭＨＣ）等。国外研究发现，某些干细胞，ＨＬＡＰ２－如人骄带干细胞或骨髓间充质干细胞，所表达的Ｉ类分子和微球蛋白的水一ＣＤ８６－平很低，而些共刺激分子如、ＣＤ８０和ＣＤ４０，Ｗ及ＨＬＡ抓在干细胞中几乎不Ｗ表达，这就提示这些干细胞可能具有低免疫原性。另外，也有研究发现，干细一胞移植后可Ｗ影响到免疫性细胞的増殖和成熟，还存在着定的免疫抑制作用。Ｗ一Ｋｉｔａｚａｗａ等研究发现，多能干细胞可抑制些异型抗原所诱导的特异性的Ｔ细Ｗ胞的増殖。Ｔｏｂｉｎ等研究发现，骨髓间充质干细胞通过抑制骨髓供体的ＣＤ４巧细胞。也有研究发现，多能干细胞，如骨髓间充，可Ｗ治疗移植后的急性排斥反应一质干细胞可Ｗ抑制促炎细胞因子的释放，进步改变细胞因子在免疫细胞分泌水平。。这些结果表明干细胞在细胞替代治疗方面具有不可替代的优势目前有许多研究关注于干细胞应用于肝细胞衰竭的治疗。１９９９年，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ一次报道将骨髓干细胞植入体内等第，可在受体的肝脏内分化为肝细胞样细胞，提示肝损伤疾病Ｗ及遗传性巧病有希望通过骨髓干细胞移植来治疗。后来的研究６１ 解放军医学院博±学位论文发现，骨髓干细胞可Ｗ促进肝细胞的再生，抑制细胞的炎症反应、细胞调亡和肝星状细胞的活化一些细胞因子和生长因子来改善肝脏的纤维化。通过分泌Ｔｓａｉ等研究发现，在肝纤维化大鼠模型体内移植入人巧带间充质干细胞，桂入的细胞可促进大鼠肝脏细胞的修复与再生，进而改善肝脏的纤维化进展。Ｄｏａｎ等一研究发现通过在肝细胞微环境下培养厮血干细胞，可Ｗ在这些干细胞中检测些巧细胞特异的表面标志的表达，并且通过与骨髓干细胞比较，巧血干细胞有移植比例更高，更具有临床应用前景。Ｉｓ，ｐ细胞与其他干细胞类似，也具有自我更新，自我繁殖的能力体外实验也。提示其具有多潜能性，在体外特定的培养条件下可Ｗ诱导为巧细胞样细胞与其一一样，他干细胞，直接注射入体内也可能在肝脏定植，通过释放些生长因子和一抗调亡因子刺激内源性肝细胞的再生，甚至有可能进步在肝脏的微环境下，分一７。，化为肝细胞样细胞，对肝损伤起到修复作用为验证送猜想，我们选择巧小鼠应用氨基半乳糖制造巧损伤模型，氨基半孔糖可Ｗ通过干扰巧脏的磯酸尿唾巧核昔的代谢一，进而导致肝细胞的变性、坏死，仅通过注射次药物，就可Ｗ获得良好的肝损伤模型。关于氨基半乳糖引起肝损伤的剂量，目前国内外的报道有很大ｉ的差异，由于本实验要求观察ｐｓ细胞在小鼠体内的定植、代谢情况，观察时间较长，应该在，，故小鼠的肝损伤不宜过重肝脏形态及生化指标上可观察到明显改变但有不会影响小鼠的存活。通过预实验，发现小鼠腹腔内注射化ＯＯｍｇ／Ｋｇ的氨基半乳糖可获得理想的肝损伤模型。在实验中选用了ＣＦＳＥ对ｉｐｓ进行巧光染色作为细胞的体内示踪剂。ＣＦＳＥ是可Ｗ固定在细胞内，结合细胞内的蛋白质，不会漏出细胞外，在细胞核的巧光最强。在细胞分裂增殖过程中，标记巧光可平均分配到子代ｓ细胞中，随着细胞的分裂细胞经尾静脉注，可Ｗ观察到巧光的强度逐渐减弱。ｉｐ，５天后应用冰冻切片可发现细胞在小鼠肝脏内定植射小鼠体内，生化检查提示注射ｉｐｓ细胞的小鼠的肝功能较未注射ｉｐｓ细胞的小鼠恢复较快。组织病理切片结果提示注射ｉｐｓ细胞后，小鼠肝脏病理损伤恢复情况较未注射ｉｐｓ细胞的小鼠有所改ｋ善，色巧光颜色逐渐变浅，但数量。随着时间延长小鼠肝脏冰冻切片观察到的绿有所増多。肝脏病理损伤方面在２０天时，小鼠肝脏炎症均获得改善，考虑小鼠对氨基半乳糖造成的肝损伤本身也有自愈作用。但发现注射ｉｐｓ细胞后，小鼠肝炎症损伤恢复较未注射ｉｐｓ细胞的小鼠明显，结合生化指标方面，注射ｉｐｓ细胞后小鼠６２ 解放军医学院博±学位论文ＡＬＴ、ＡＳＴ下降速度较未注射ｉｐｓ细胞时要快，提示ｉｐｓ细胞注射入肝损伤动物体内，一一一可能对肝功能损害有定的修复作用，但是否进步在肝脏的微环境下进步分一一化为巧细胞样细胞，仍需进步的研究来证实。本实验仅为对ｉｐｓ细胞的这功能一一的初步研究，还需要进步的实验来明确ｉｓ这功能的具体的发生机制ｐ。’四、小结１．Ｃ５７肝损伤小鼠成功建模。２．Ｉｓ细胞注射入肝损伤的小鼠细胞体内，可在小鼠肝脏细胞内定植，临床上ｐ有助于肝功能的恢复，组织病理学上可看到有助于肝脏炎症的恢复。６３ 解放军医学院博±学位论文总结－１．通过应用含有化ｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、Ｋｌｆ４基因的逆转录病毒，将人包皮成纤维细胞在体外诱导为ｉＰＳ细胞。２．对所诱导的ｉＰＳ细胞进行了生物学鉴定，证实了其在形态学上类似ＥＳ细胞，ＥＳ，，碱性磯酸酶活性为阳性免疫英光染色可表达类似细胞的特异性蛋白质ＲＴ－ＰＣＲＥＳＳＣＩＤ检测可表达与类似的基因，体外实验提示可分化为类胚体，注射鼠可形成崎胎瘤，。提示所诱导的ｉｓ细胞具有类似防细胞的多潜核型分析．巿常ｐ能性。３．对前述实验中所获得的ｉｐｓ细胞经诱导成功分化为了肝细胞样细胞。诱导过程中各阶段的标志物经免疫萊光染色及流式染色验证正确，分化效率高。获得的肝细胞样细胞经Ｅｌｉｓａ方法检测ＡＬＢ的分泌量，ＰＡＳ染色检测糖原化存功能，－ＲＴ－ＰＣＲＲｅａｍｅＰＣＲ检及ｌｔｉ测特异性基因的表达，提示通过诱导获得了成熟肝细胞的功能的肝细胞样细胞。４．诱导的ｉｐｓ细胞经萊光标记后经尾静脉注射入急性肝损伤的Ｃ５７小鼠体内，可在小鼠体内増殖，改善肝损伤小鼠的肝脏炎症改变。５．通过上述实验结果，为生物人工肝治疗提供了新的肝细胞来源，为肝损伤的治疗提供了新的思路。６４ 解放军睦学院樽＋学位论文参考文献１．Ｃｈａｍｕｌｅａｕ民ＡＤｅｕｒｈｏｌｔＴＨｏｄｃｓｔｒａ艮．Ｗｈｉｃｈａｒｅ化ｅｒｉｈｔｃｅｌｌｓｔｏｂｅｕｓｅｄｉｎａ，，ｇｂ－ｉｏａｒｄｆｉｃｉａｌｌｉｖｅｒ？ＭｅｔａｂｏｌｉｃＢｒａｉｎＤｉｓｅａｓｅ２００５２０４：３２７３３５．，，（）２民民Ｋｕｍｔ．ＡｎａｎｄＡＣＢｈｏｎｄｅＳｅｔａｌ．Ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｉｖｅｒｆｒｏｍｃｕｌｔｕｒｅｄｈｕｍａｎｆｅａｌ，，，ｐｔｔｉｉｌ－ｈｅａｏｃｅｓｉｔｓ．ＴｒＧｔｔ２００１２１１２２２７：ｆｅａｓｂｔａｎｄｒｏｓｅｃｏａｓｒｏｅｎｏｌ：．ｐｙｙｐｐｐ，，（）Ｅ－－３．ＵｃａｙａｍＴＡｍｉｔａＳｈａｒｕｔＳＤｖｉｒＧｉｎｚｂｅｒｅｔａｌ．ＥｎｈａｎｃｉｎｔｈｅＤｒｕ，ｙｐ，ｇＭ，ｇｇｔＡｔｖｉｔ＿—ＭｅａｂｏｉｅｓｏｆＣ３ＡＡＨｕｍａｎＨｅａｏｃｔｅＣＬｎｅＢｉｓｓｕｅｌｉｓｍｃｉｐｔｙｅｌｌｉｙＴＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＷＵｈｉｎＡｌｇｉｎａｔｅＳｃａｆｆｏｌｄｓ．ＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００６，１２（５）：１３５７３－１３６８．４Ｓｔｔ．ＴａｋａｈａｓｈｉＫＹａｍａｎａｋａ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｌｕｒｉｏｅｎｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅ，ｐｐｅｍｂｒｏｎｉｃａｎｄａｄｕｌｔ打ｂｒｏｂｌａｓｔｃｕｌｔｕｒｅｓｂｄｅｆｉｎｅｄｙｙ＊ａｃｏｒｓ－ｆｔ．Ｃｅ：．ｌｌ２００６１２６４６６３６７６，，（）５．ＴａｋａｈａｓｈｉＫＴａｎａｂｅＫＯｈｍｉｋｉＭｅｔａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏ打ｏｆｌｕｒｉｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍ’，，ｐｐ－ａｄｕｆｔ１１２００７１３１５．ｌｔｈｕｍａｎｉｂｒｏｂｌａｓｓｂｄｅｆｉｎｅｄ化幻〇［３．〇６：８６１８７２ｙ，，（）６ＭＡ－Ｉ．ＹｕＪＶｏｄａｎ化ＳｍｕａＯｔｔｏＫｅｔａｌ．ｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｏｔｅｎｔｓ化ｍｃｅｌｌｌｉｎｅｓｄｅｒｉｖｅｄ，ｙ，ｇ，ｐｐｔｉｌ￣ｆｒｏｍｈｕｍａｎｓｏｍａｃｃｅｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００７３１８５８５８１９１７１９２０：．，，（）７ＺｈａｏＸＹＬｉＷＬｖＺｅｔａｌＰＳｃｅｓｒｏｉａｂｌｅｍｃｅｔｈｒｏｕｈｔｅｔｒａｌｏｉｄ．，．ｉｌｌｄｕｃｅｖｉ，，ｐｇｐｃｏｍ－ＩｅｍｅｎｔａｔｉｏｎＪ．Ｎａｔｕｒｅ２００９４６１７２６０：％９０．ｐ［］，，（）８．ＫａｎｇＬ，ＷａｎｇＪ，ＺｈａｎｇＹ，幻ａｌ．ｉＰＳｃｅｌｌｓｃａ打ｓｕｐｐｏｒｔｆｌＵｌｔｅｒｍｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｔｌ化＾ＪＣ２００９５２－ｅｒａｏｉｄｂｉａｓｃｓｃｏｍｌｅｍｅｎｔｅｄｅ：１１３８ｔｎｂｒｏｓ．ｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ３５．ｐｙｐｙ［］，，（）９．ＢｏｌａｎｄＭＪＨａｚｅｎＪＬＮａｚｏｒＫＬｅｔａｌ．Ａｄｕｌｔｍｉｃｅｅｎｅｒａｔｅｄｆｒｏｍｉｎｄｕｃｅｄ，，，ｇ－ｔｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓＪ．Ｎａｔｕ２００９４６１７２６０：９１９４．ｌｕｒｉｏｅｎｒｅｐｐ［，］，（）－ｆｌｓｔ１０ＫａｉＫＮｏｒｒｂＫＰａｃａＡｅｔａｌＶｉｍｓｆｒｅｅｉｎｄｕｃｔｉｏ打ｏｕｒｉｏｔｅ打ｃａｎｄｕｂｓｅｕｅｎ．，．ｊ，ｙ，ｐｐｙｑ－ｅｘｃｔ．Ｎ２００９４５８７２３９７７１．ｉｓｉｏｎｏｆｒｅｒｏｒａｍｍｉｎｇｆａｃｏｒｓａｔｕｒｅ：７７５ｐｇ，，（）１１．ＷｏｌｔｅｎＫＭｏｈｓｅｎｉＰｅｔａ．ＢｔｍｓＭｉｃｈａｅｌＩＰｌｉａｃｔｒａｎｓｏｓｉｉｏｎｒｅｒｏｒａｊ，，，ｐｇｇｙｐｐｇｒ－ｌｕｉ．Ｎａｔｕｒｅ２００９４５８７２３９：７６６７７０加ｒｏｂｌａｓｔｓ化ｉｎｄｕｃｅｄｐｏ化ｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．，，ｐ（），１２ｏ－ｌｄｎｅｒＦＨｏｃｋｅｍｅｅｒＤＢｅａｒｄＣｅｔａ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｓｄｉｓｅａｓｅａｔｉｅｎｔｄｅｒｉｖｅｄ．Ｓｙｌ，，，ｐ＊ｎｄｕｃｅｄｕｒｏｂｎｔｓｔ；ｅｍｃｅｌｓｅｅｏｆｉａｒｅｒｏｒａｍｍｉｎｉｐｌｉｐｌｆｒｖｉｌｐｇｇＵ）ｒｓＣｅ－ｆａｃｌｌ２００９１３６５：％９７７．４．，，（）１３．Ｌｔ．ｉｉｔｔｌｌｆｒｔｉｕＨＺｈｕＦＹｏ打ＪｅａｌＧｅｎｅｒａｔｏｎｏｆｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｏｅｎｔｓｅｍｃｅｓｏｍａｄｕｌ，，，ｇｐｐ－巧０ｒｈｅｓｕｓｍｏｎｋｅｆｔ．．２００８．ｙｉｂｒｏｂｌａｓｓＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ３６：５８７；（）１４ＬＪＣｈＳｔｔｏｃｅｎｅｓｏｍ．ｉａｏＣｕｉＣｅｎｅａｌ．Ｇｅｎｅｒａｉｏ打ｏｆｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｔｅｎｔｓｔｅｍｌｌｌｉｆｒ，，，ｐｐｔｔｌＪＳｔｅｍＣｅ２００９４１１－１５ａｄｕ．ｌｒａｃｅｌｓ．Ｃｅｌｌｌｌ１：＿，［］，（）６５ 解放军輕学院博＋学位论文１５．ＥｓｔｅｂａｎＭＡＸｕＪＹａ打Ｊｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏ打ｏｆｕｃｅｄｒｏ打ｔｍｃｅｓｉｎｄｌｕｉｔｅｓｔｅｌｌｌｉｎｅ，，ｇ，ｐｐＪＪＢｉ－ｆｒｏｍｔｉｂｅｔａｎｍｌＣｈｅｍ２００９２８４２６：１７６３４１７ｉ打ｉａｔｕｒｅｉｏ６４０．ｐｇ，，［］（）６ＺＣｈＪＪｔｌＧｅ打ｅｔｃｅｄｔｔｌｌｉｔ１．Ｗｕｅｎ民ｅｎｅａ．ｒａｉｏｎｏｆｉｉｎｄｕｌｕｒｉｏｔｅｎｓｅｍｃｅｓｗｈａ，，，ｐｇｐｐ－ｔＪ＿ｄｒｕ．ＪＭＣｌｌＢ２〇〇９ｌｌ：４６５４ｉｎｄｕｃ化ｌｅｓｅｍｏｌｅｉｏ．ｇ巧［］，，（）１７．ＬｉｕＨＳＺｈｕＦＦＹｏｎＪｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｄｕｃｅｄｈｉｒｉｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｄｌｓｆｒｏｍ，，ｇ，ｐｐ－ａｄｕ．：．ｌｔｒｈｅｓｕｓｍｏｎｋｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ２００８３６５８７５９０ｙ，，（）１８ＤＨＪＬｉｕＭｔ．ｍＥｓ．ＺｈａｎｉａｎＷｅａｌＨｉｈｌｅｆｉｃｉｅｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏ打ｏｆｈｕａｎＳｃｅｌｌｇ，ｇ，，ｇｙ－ａｎｄｌｔｔｔｉＣｉＰＳｃｅｌｓｉｎｏｍａｕｒｅｐａｎｃｒｅａｉｃｉｎｓｕｌｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇｃｅｌｌｓ．ｅｌｌＲｅｓ２００９１９４：４２９＾３８．，，（）１９－．ＳｏｎＺＨＣａｉＪＬｉｕＹＸｅｔａｌ．Ｅｉｅｎｔｅｎｅｒａｔｔｔｉｌｆｉｃｉｏｎｏｆｈｅａｏｃｅｌｋｅｃｅｌｓｆｒｏｍｇ，，，ｇｐｙｔｔｔ－ｈｕｍａｎｌｌＣ民２００９１９１１１２３３１２４２ｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｏｅｎｓｅｍｃｅｓ．ｅｌｌｅｓ：．ｐｐ，，（）２０．ＬｉＷＩ＾，ＷｅｉＷ，ＺｈｕＳＹ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｒａｔａｎｄｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐ山ｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｙｃｏｍｂｉｎｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃｒｅｒｏｇｒａｍｍｉｎｇａ打ｄｃｈｅｍｉｃａｌｉｎｈｉｂｉ化ｒｓ．ＣｅｌｌＳｔｅｍｐ－Ｃｅ：１ｌｌ２００９４１６１９．，，（）２１．ＷｕＺＣｈｅｎＪＪ民ｅｎＪＴｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｄｕｃｅｄｕｒｏｓｅｍｃｅｓｗｔａｉｌｉ化ｎｔｔｌｌｉｈ’，，ｐｇｐｐ－ｉｔｅＭｌＣ２００９ｌｌ－ｄｒｕｎｄｕｃｍＪ：４６５４ｉｂｌｅｓｓｏｅｌｌＢｉｏｌ．ｇｙ，，（）２２ＢＣＡＹＭＡ？ＣＪｔａＬＡｔｔｉｉ．ｒｅｎｎｅｒＷｏｌｎｄｌｅｉ民艮ｏｈｅｎ．ｅｌｅｒｎａｖｅｓｌｉｃｎｏｆ化ｅ，，，ｙｐｇｔｅｏｍｅｒａｓｅｃａｔａ．ｌｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔｉｎｈｕｍａｎｏｏｃｔｅｓａｎｄｅｍｂｒｏｓ．ＭｏｌＨｕｍ民ｅｒｏｄ巧ｌｙｙｙｐ］１９９９５９－：８４５８５０．，（）２３．ＭｏｒｒｉｓｏｎＧＢｒｉｃｋｍａｎＪＭＣｏ打ｓｅｒｖｅｄｒｏｌｅｓｆｏｒＯｃｔ４ｈｏｍｏｌｏｕｅｓｉｎＭ．，ｇｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙｄｕｒｉｎｇｅａｒｌｙｖｅｒｔｅｂｒａ化ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．－２００６１３３１０：２０１１２０２２．；（）２４ＨＫｕｍＭＦＤｔ．Ｉｌｔｔｔｔｔ．ＹｕａｒＳａｎｅａｌｓｏａｉｏ打ｏｆａｎｏｖｅｌｏｕｌａｉｏｎｏｆｍｕｌｉｏｅｎ，，ｇ，ｐｐｐｔｔ－ａｄｕｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｕｍａｎ．ｈａｉｒｆｏｌｌｉｃｌｅｓ．ＡｍＪＰａｈｏｌ．２００６１６８６：１８７９１８８８；（）２５ｔＪＫＬｔ．ＭｕｔＳＯＸ２Ｉ．Ｆａｎ：ｅｓ民ａｅＮｎｃｈＳＡｅａｌａｔｉｏｎｓｉｎｃａｕｓｅａｎｏｈｌ：ｈａｍｉａ，ｇｇ，ｙ，ｐｔ２００３４６１－４６［Ｊ］．ＮａｔＧｅｎｅ，，３３４；３．（）２６ＳＹＹＫＯｈＭｅｔａ．ＨＵｔｌｔｔ．ａｎａｄａｏｓｈｉｄａａｒａｌｉｓ）ａｈｏｌｏｉｃｅｖａｕａｉｏｎｏｆｓｅｗｉｓｅ，，，ｐｇｐｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａｗｉｔｈｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｓｉｓｏｆａｓｔｒｉｃｐｙｇｅｐｋｈｅｌｉａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｄｏｒＳＯＸ２乂ｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏ打ｐａｔｔｅｒｎｓｂｅｔｗｅｅｎｎｖａｓｖｅｃｏｍｏｎｅｎｓａｎｒｏｕｓｏｒｎｏｎｎｅｏａｓｃａｄｕｃａｃｏｍｏｎｅｎｓｉｉｐｔｄｃａｎｃｅｐｌｔｉｉｎ化ｔｌｐｔ－．ａｎｃｒｅａｓ．［Ｊ］Ｐ，２００６，３２２：１６４１７０（）２７民ｏｄｒｉｕｅｚ－ＰｎａＳａｒｒｏＤｏｒｅｎｏ－Ｂｕｅｎｏｅｔａ．Ｓｏｘ２：ａｏｓｓｅｖｅｒｏｆ．ｇｉｉｌｌＳＭｉＭｌｉｂｌｄｒｉ，，Ｑｐｅｂａｓａｌ－ｌＭｏｄＰａ化ｏｌ－ｉｋｅｈｅｎｏｔｅｉｎｓｏｒａｄｉｃｂ代ａｓｔｃａｎｃｅｒ２００７２０４：４７４８１化ｐｙｐｐ．．．；（）６６ 解放军医学院瞎十学位论文２８ＳＮＹＹｌ．Ｍａｓｕｉａｋａｔａｋｅｏｏｏｋａｅｔａ．Ｐｌｕｒｉｏｔｅ打ｃｏｖｅｒｎｅｄｂＳｏｘ２ｖｉａ，，Ｔｙ，ｐｙｇｙｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆＯｃｔ３／４ｅｘｒｅｓｓｉｏ打ｉｎｍｏｕｓｅｅｍｂｒｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓＪ．ＮａｔＣｅｌｌｇｐｙ［］Ｂ－ｉｏ：６２５６３５ｌ，２００７，９６．（）２９ｔ．ＴａｋａｈａｓｈｉＫＹａｍａｎａｋａＳ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｌｕｒｉｏｔｏｉｔｓｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅ’ｐｐｅｍｂｒｏｎｉｃａｎｄａｄｕｌｔ做ｒｏｂｌａｓｔｃ山ｔｕｒｅｓｂｄｅｆｉｎｅｄｆａｃ１：ｏｒｓ＊Ｊ．Ｃｅｌｌｙｙ［，］２００６２６４－：６６３６７６．，（）３０ＹｕＪＶｏＭＡＳｍｕ－ＯｔｔｏＫｔ．Ｉｎｔｔｔｃｌ．ｄａｎ化ａｅａｌｄｕｃｅｄｌｕｒｉｏｅｎｓｅｍｅｌｌｉｎｅｓ，ｙ，ｇ，ｐｐ－ｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓＪＳｃ２００７３１８５８５８１９１７１９２０．．ｉｅｎｃｅ：［，，］（）３１．ＺｈａｎＪＷｉｌｓｏｎＧＦＳｏｅｒｅｎｓＡＧｅｔａｌＦｕｎｃｔｉｏｎａｃａｒｄｏｍｏｃｅｓｄｅｒｖｅｄｆｒｏｍｇ．ｌｉｔｉ，，，ｙｙｈｕｍａｎ－ｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓＪ．ＣｉｒｃＲｅｓ２００９１０４４：ｅ３０４１．ｐｐ［］，，（）３２ｔｔ－ｔｔ．ＯｋｉａＫＩｃｈｉｓａｋａＴａｍａｎａｋａＳ．Ｇｅｎｅｒａｉｏｎｏｆｅｒｍｌｉ打ｅｃｏｍｅｅｎｉｎｄｕｃｅｄ，，ＹｇｐｌｔｔｔＪ－ｕｒｉｅｅｎｓｅｍｃｅ．Ｎ２００７４４８１５１３１３３１７．ｌｌｓａｔｕｒｅ７：ｐｐ［］，，（）３３－．ＳｏｎＺＣａｉＪＬＹｔａ．Ｅｔｔｆｔｔｆｒｉｕｅｌｆｆｉｃｉｅｎｅ打ｅｒａｉｏｎｏｈｅａｏｃｅｌｉｋｅｃｅｌｌｓｏｍｈｕｍａｎｇ，，，ｇｐｙｃｅｄｌｕｏｔｅｎｓｅｍｃｅｓＣｅｌ－ｌ．２００１９：１２３１２４２ｉｎｄｕｐｒｉｔｔｌｌ．民ｅｓ９Ｎｏｖ１３．ｐ；（７）３４．ＴａｋａｔａＡＯｔｓｕｋａＭＫｏｉｓｏＴｅｔａｌ．Ｄｉｒｅｃｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｅａｔｉｃｃｅｌｌｓｆｒｏｍ，，ｇ，ｐｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇａｌｉｍｋｅｄｎｕｍｂｅｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓＪ．Ｈｅｐａ［］Ｉｔｅ８９０—ｎ，２０１１，５４８９８．：（）＊３５Ｗ—．ＣｈｅｎＹＦＴｓｅｎＣＹａｎＨＷｅｔａｌ民ｔｔｔｔ．ａｉｄｅｎｅｒａｉｏｎｏｆｍａｕｒｅｈｅａｏｅｅｌｉｋｅ，ｇ，ｇ，ｐｇｐｙｃｅｌｈｕｍｔｔｔ—ｔｌｓｆｒｏｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｅｎｔｓｅｍｃｅｌｌｓｂｙａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｈｒｅｅｓｅｐＣ〇ａｏｏ－ｒｏＵ．，１）ｌＪＨｑ）ｔｌ，２０１２５５４；１１９３２０３．ｐ［］ｇｙ（）－３６．ＴａｅｂＫＮｏｔｏＦＫＮａａｏｋａＭｅｔａｌｉＳｉ．Ｈｈｌｅｆｆｉｃｉｅｎｔｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｙ，，ｇ，ｇｙｇ－ｔｌｈｅａ．．０１０５１ｔ；ｏｃｔｅｌ化ｅｃｅｌｌｓｆｒｏｍｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｏｋｎｔｓｅｍｃｅｌｓＨｅａｔｏｌｏ２ｐｙｐｐｐｇｙ；－ｌ２９７．：３０５（）３７．ＬｉＷ，ＷａｎｇＤ，ＱｉｎＪ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｆｔｍｃｔｉｏｎａｌｈｅｐａｔ；ｏｃｙｔｅｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓ化ｍｃｅｌｌｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌｕｌａｒＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２０—１０２２２３：４９２５０１；（）３８．ＣｈｉｓｔｉａｋｏｖＤＡａｎｄＣｈｉｓｔｉａｋｏｖＰＡ：Ｓ化ａｔｅｇｉｅｓｔｏｐｒｏｄｕｃｅｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓａｎｄｈｅａｔｏｃｔｅ－Ｈｋｅｔｔ－ｃｅｌｌｓｆｒｏｍｌｕｒｉｏｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｈｅａｏｌ民ｅｓ４２：１１１１１９２０１２．ｐｙｐｐｐ，－３９．ＴｏｍＭＴＩｔＣｔ．ＨｔｔｉｚａｗａｏａｍａＹｏｅａｌｅａｏｂｌａｓｌｉｋｅｃｅｌｌｓｅｎｒｉｃｈｅｄｆｒｏｍｍｏｕｓｅ，ｙ，，ｐｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｍｅｄｉｕｍｗｉ化ｏｕｔｇｌｕｃｏｓｅ，ｐｙｒｕｖａｔｅ，ａｒｇｉｎｉｎｅ，ａｎｄｔｙｒｏｓｉｎｅ．Ｃｅ民３３３７－２７２００８ｌｌＴｉｓｓｕｅｅｓ：１．，４０—ｆ．ＳｕｌｚｂａｃｈｅｒＳＳｃｈｒｏｅｄｅｒＩＳＴｒｕｏｎＴＴｅｔａｌ．ＡｃｔｉｖｉｎＡｉｎｄｕｃｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏ，，ｇ，６７ 解放军度学院博＋学位论文ｅｍｂｒｏｎｃｓ—ｔｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｏｅ打ｄｏｄｅｒｍａｎｄａ打ｃｒｅａｔｉｃｒｏｅ打ｈｏｒｓｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｙｉｐｐｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆｋｃｔｏｒｓａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ＾．ＳｔｅｍＣｅｌｌ民ｅｖ，２００９，５２：］（）—１５９１７３．—４１．ＢｏｕｌｔｅｒＬ＾ＧｏｖａｅｒｅＯＢｉｒｄＴＧｅｔａ．ＭｈｅｔｏｏＮｏｔｃｈｌａｃｍａｄｅｒｉｖｅｄＷｎｓｅｓ，，，ｐｇｐｐｓｉｇｎａｌｉｎｇｔｏｓｐｅｃｉｆｙｈｅｐａｔｉｃｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｆａｔｅｉｎｃｈｒｏｎｉｃｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅＪ．Ｎａｔ［］Ｍｅｄ—，２０１２，１８４５７２５７９：．（）４２．ＳｕｌｌｉｖａｎＧＪＨａＤＣＰａｒｋＩＨｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｆｌｍｃｔｉｏｎａｌｈｕｍａｎｈｅａｔｉｃ，ｙ，，ｐｒｍｆｒｏｍｈａｎｉｎｄｕｃｅｄ．ｅｎｄｏｄｅｕｍｌｕｒｉｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅＩｌｓＪＨｅａｔｏｌｏ，２０１０，５１１：ｐｐ［］ｐｇｙ（）３２９—３３５．４３．ＳｃｈｍｉｄｔＣＢｌａｄｔＦＧｏｅｄｅｃｋｅＳｅｔａＬＳｃａｔｔｅｒｆａｃｔｏｒ／ｈｅａｔｏｃｔｅｒｏｗ化ｆａｃｔｏｒ，，ｐｇ，ｙ＾ｓｓｅｎａｒｄｅｖｅｌｏｍｅｎ－ｉｓｅｔｉｌｆｂｒｌｉｖｅｔ．Ｎａｔｕｉｅ．１９９５３７３：６９９７０２．ｐ；－４４ｉｅｗｏｎＳｃｈｅｒｌｅ．ｌｏｉｎｃａ化ｗａｉｎｈ化ｉｔｏｒｓｆｏｒｃａｎｃｅ．ＬｕＸＮｔ民ＣＰＡＤｅｖｅＭＥＴｒ，，ｐｇｐｙｅｒａ１￣化：ｒｏｒｅｓｓａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．ＴｒｅｎｄｓＭｏｌＭｅｄ．２００１６：３７４５．ｐｙｐｇ；４５．ＧｒｏｔｅｕｔＳｖｏｎＳｃｈｗｅｉｎｉｔｚＤＣｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉＧｅｔａｌ．Ｈｅａｔｏｃｔｅｒｏｗｔ：ｈｆａｃｔｏｒｇ，，，ｐｙｇｉｎｃｅｓｃｅｓｃａｔｔｅｒＭＡＰＫ／巨－－ｄｕｉｎｔｈｒｏｕｒ１ｍｅｄｉａｔｅｄｕｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆＳｎａｉｌｌｇｇｈｇｐｇｌ．ＥＭ巨ＯＪ２００６２５＾：３５３４３５４５．．；Ｐ－ＭＭＩｔ４６ｌ．Ｔｈｔｔｔ．ＣａｎｏＡｅｒｅｚｏｒｅｎｏＡ民ｏｄｒｉｏｅａｅｒａｎｓｃｒｉｉｏｎｆｋｃｏｒｓｎａｉｌ，，ｇ，ｐ－ｍａ－ｃｏｎｔｒｏｌｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｍｅｓｅｎｃｈｙｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓｂｙｒｅｒｅｓｓｉｎｃａｄｈｅｒｉ打ｅｘｒｅｓｓｉｏｎ．ｐ呂Ｅｐ－ＮａｔＣｅｌｌＢｉｏ．ｌ．２０００２：７６８３；４７．Ｓ打ｋｅｒｓＳＤｅＫｏｃｋＪ民ｏｉｅｒｓ乂ｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｔｒｏｄｉｆｆｅｗｎｔｉａｔｉｏ打ｏｆｅｍｂｒｏｎｉｃａｎｄｙ，，ｇｙａｄ山ｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｏｈｅａｔｏｃｔｅｓ：ｓ１：ａ化ｏｆ也ｅａｒｔ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２００９２７：５７７ｅ６０５．ｐｙ；４８．ＣｈｉａｎｇＣＨ，Ｃｈａ打ｇＣＣ，ＨｕａｎｇＨＣ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｋ）ｐｒｏ化ｃｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉ打ｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔ：ｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉ打ｔｈｅｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆｌｉｖｅｒｉ打ｕｒ．Ｊ艮ｉｏｍｅｄｊｙＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０１１２０１１：２１９０６０．；４９ＬＹｔ．民ｅｒｏｒａｍｍｔｔ．ｉＨＹＣｈｉｅｎＣｈｅｎＹＪｅａｌｉｎｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｏｌ：ｅｎｓｅｍｃｅｌｌｓｉｎ，，ｐｇｇｐｐ，ｅａｂｓｅｎｃｅｏｆ－ｃｅｒｅｎｔ－Ｍｉａｏｎｎｏｈｅａｔｏｃｅｅｃｅｓ．ｏｍａａｓ１；ｈｃｙＩｂｒｄｉｆｆｔｉｉｔｐｙｔｌｉｋｌｌＢｉ化ｒｉｌ２０１１３２：巧９４ｅ６００５．；５０ＫｔＩａｎ－ＫａｒｓｅｎｔｉＤＳｎｉｒＭｅｔａＫｅｎｌＨｕｍａｒｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｓｃａｎ．ｅｈａｉ．ｎｅｍｂｌ，ｙｇ，，ｙｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｍｙｏｃｙｔｅｓｗｉｔ：ｈｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｏｅｒｔｉｅｓｏｆｐｐｔ－ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｅｓ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ２００１１０３：４０７４１４．．８ｙ；（）５１Ｍ－．ＤｅｕｓｅＴＳＵＴＫ．Ｉｍｍｕｎｏｔｉｂｂｅｎｄｏｒｆｆａｎｕａｎｅｔａｌｅｎｉｃｉａｎｄ，，，ｇＱｇｙｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙｒｏｅｒｔｉｅｓｏｆｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｌｉｎｉ打ｍｅｓｅ打ｃｈｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｐｐｇｙ６８ 解放军輕学院博＋学侦论文ＣｅｌｌＴｒａｎｓｌａｎｔ－ｐ．２０１１苗０５：６５５６６７．（）－５２．ＫｉｔａｚａｗａＹＬｉＸＫＸｉｅＬｅｔａｌｔｔｔ．Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｄｅｒｉｖｅｄｃｏｎｖｅｎｉｏｎａｌｂｕｎｏｃｌｏｎｅｄ，，，，，ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｓｕｐｐｒｅｓｓｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｒｅｖｅｎｔｐｐ－－－－ｒａｆｔｖｅｒｓｕｓｈｏｓｔｄｉｓｅａｓｅ．ＣＴｔ．２０１２２３５８１．ｇｉｎｒａｔｓｅｌｌｒａｎｓｌａｎ２１：５９０ｐ；（）５３．ＴｏｂｉｎＬＭ，ＨｅａｌｙＭＥ，ＥｎｇｌｉｓｈＫ，ｅｔａｌ．ＨｕｍａｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｓｕｐｐｒｅｓｓｄｏｎｏｒＣＤ４＋Ｔｃｅｌｌｒｏｅｒａｔｏｎａｎｄｒｅｃｅａｔｏｌｏｉｎａｈｕｍａｎｉｚｅｄｍｏｕｓｅｐｌｉｆｉｄｕｐｈｇｙ（）ｍｏｄｅｌｏｆ－－－ａｃｕｔｅｒａｆｔｖｅｒｓｕｓｈｏｓｔｄｉｓｅａｓｅｌｉｎＥｘＩｍｍｕｎｏｌ．２０１３１７２２：３３３３４８．ｇ．Ｃｐ；（）５４．ＡａｒｗａｌＳＰｉｔｔｅｎｅｒＩＶＩＦ．Ｈｕｍａｎｍｅｓｅ打ｃｈｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｍｏｄｕｌａｒａｌｌｏｅｎｅｉｃｇｇ，ｇｙｇ０５４１８１－１８２２．ｉｍｍｕｎｅｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｂｌｏｏｄ，２００５１：５；（）５５．ＰｅｔｅｒｓｅｎＢＥＢｏｗｅｎＷＣＰａｔｒｅｎｅＫＤＳｕｒａｓｅｏｓＭａｒｓＷＭｌｌｉｖａｎＡＫＭｕＮＢ，，，，，，ｇｇＳＳ，ＧｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒＪＳ，ＧｏｆＪＰ．Ｂｏ打ｅｍａｒｒｏｗａｓａｏｔｅｎｔｉａｌｓｏｕｒｃｅｏｆｈｅｐａｔｉｃｏｖａｌｐｃｅ－ｌｌｓｃｅｎｃｅ９５４１７：１１６８１１７０．Ｓｉ．１９９苗８４．（）５６．ＬｉｕＦＬｉｕＺＤＷｕＮｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｌａｎｔｅｄｅ打ｄｏ化ｄｉａｌｒｏｅｎｉ化ｒｃｅｌｌｓａｍｅｌｉｏｒａｔｅ，，，ｐｐｇｔｔ－ｃａｒｂｏｎｅｒａｃｈｉｉｔＬｉＴ．ｌｏｒｄｅｎｄｕｃｅｄｌｉｖｅｒｃｉｒｒｈｏｓｉｓｉｎｒａｓ．ｖｅｒｒａｎｓｐｌ２００９１５９１０９２－１１：００．；（）５７．ＭｕｒａｃａＭ．Ｅｖｏｌｖｉｎｇｃｏｎｃｅｐｔｓｉｎｃｅｌｌｔｉｅｒａｐｙｏｆｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅａｎｄｃｕｒｒｅｎｔｃｌｉｎｉｃａｌ－ｅｒｓｅｃｔｉｖｅｓＤｉＬｉｖｅｒＤｓ．２０１４３３：１１．ｐｐ．ｇｉ１８０８７；（）ｔＣＪ－５８．Ａｔｌｉ．ＪＭ２０００１０７：５６７５７４？民ｕｓＧｏｒｅｓＧｏｏｓｉｓａｎｄｖｅｒｄｉｓｅａｓｅＡｍｅｄ．８，ｐｐ；（）５９．ＴｓａｉＰＣＦｕＴＷＣｈｅｎＹＭｅｔａｌ．Ｔｈｅ化ｅｒａｅｕｔｉｃｏ化ｎｔｉａｌｏｆｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌ，，，ｐｐｅｍ＇ｍｅｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｃｅｌｌｓｆｒｏｍＷｈａｒｔｏ打ｓｅｌｌｉｎ化ｅｈｅａｔｔｏｆｒａｔｌｉｖｅｒ行ｂｒｏｓｉｓ．ｊｙＬ－ｉｖｅｒＴｒａｎｓｌ．２００９１５５：４８４４９５ｐ．；（）６０．ＤｏａｎＣＣ，ＬｅＴＬ，ＨｏａｎｇＮＳ，ｅｔａｌ．Ｄｉｆｅｒｅ打ｔｉａｔｉｏｎｏｆｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｌｉｎｉｎｇｍｅｍｂｒａ打ｅ－ｉｍａｔ化ｌｉ－ｅｓＩｒａｎＢｉｏｍｅｄｄｅｒｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｌｓｅｍｃｅｌｌｓｉｎＵ）ｅｎｄｏｅａｌ１化ｅｃｌｌ．Ｊ－．２０１４１８２７７５：６．；（）６９ 解放军医学院博＋学位论文文献综述巧导性多能干细胞与肝脏疾病研究相关进展王建军万志红综述，辛绍杰、赵平审校摘要；通过导入特定的转录因子可将分化的体细胞重编程为诱导性多能干细胞（Ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｉＰＳｃｅｌｌｓ），目前的研究已经证实其可Ｗ成功的衍生出肝细胞，通过构建人肝脏代谢疾病的模型，在研究代谢性肝病的病理生理学，发现新的药物和制定再生组织的策略方面有巨大的应用潜能。同时，ｉＰＳ分化的肝细胞在巧脏细胞替代治疗的研究应用中可能具有重要的意义。关键词：诱导性多能干细胞，代谢性肝病，细胞替代治疗。一些遗传代谢性肝病的病理生理机制的研究目前只能通过家族谱系或完全分化的细胞来观察。通过疾病的动物模型的建立来研究疾病的发生机制，筛选新的治疗药物或发现药物的新的治疗作用。诱导性多能干细胞（ＩｎｄｕｃｅｄＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓｉＰＳＣ）是指具有形成人和动物个体所有类型细胞的多向分化潜能、，可一１＾不断自我更新的类细胞，可Ｗ很容易的从单个病人的体细胞获得，这就使得它成为一个强有力的工具，可Ｗ通过它来了解遗传性的疾病的发病机制和临床疾病表现的关系，利于筛选新的治疗药物和发现药物新的药理作用。同时，由于＾其具有自我更新，、增殖和分化的全能性却绕开了胚胎干细胞研究直面临的伦理和法律等诸多障碍，已成为细胞替代治疗新的研究热点。１ｉＰＳ细胞的发展历史２００６Ｔａｋａｈａｓｈ＇Ｊ年８月，ｉ和Ｙａｍａｎａｋａ通过在分化的胎鼠成纤维细胞中表达－Ｍｙｃ和Ｋ某些特定转录因子０ｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃｌｆ４（也称为Ｙａｍａｎａｋａ因子），诱导体■＇细胞的重编程而获得与ＥＳ细胞相似的细胞。这些细胞可不断自我更新和具有发育多潜能性，因此被命名为诱导多潜能性干细胞（ｉＰＳ细胞）。２００７年１１月他们又，利用４种同样的转录因子将人的皮肤成纤维细胞诱导为ｉＰＳ细胞气２００７年１２月一Ｙｕ一０ｃｔ４Ｓｏｘ２ＮａｎｏＬＪ等筛选出了另外套用于诱导的基因组合、、ｇ和ｉｎ２８建７０ 解放军睦学院博＋学化论文立人ｉＰＳ细胞，而不是常用的Ｙａｍａｎａｋａ因子。随后，他们利用这４种因子使人类新化儿成纤维细胞重构为ＩＰＳ细胞２００９ｉＰＳ年，多个科研小组先后报道了通过四倍体囊化注射细胞可Ｗ获得存ｉ＇ｅｉ活并具有繁殖能力的ｉＰＳ小鼠。这证明通过表达Ｙａｍａｎａｋａ因子可诱导分化细胞形成具有真正发育多潜能性的干细胞，尽管不同ｉＰＳ细胞系之间有较大的差异。在建立小鼠ｉＰＳ细胞后，应用相似的方法，也很快地建立了人ｉＰＳ细胞。日本东京大学研究人员证明用ｉＰＳ细胞培巧人类红细胞和白细胞都是可能的。化ｇｙ研究＾＾＾Ｋａｉｖ－ｆｒｅｅ组和ｊ小组采用转座子介导的方法高效率制备了ｉｒｕｓ鼠ｉＰＳ细胞，ｉＰＳ细胞后ａｅｎｉｓｃｈ获得，又成功将先前导入的转录因子基因从ｉＰＳ细胞中移除。Ｊ小组将移除外源基因的人ｉＰＳ细胞成功诱导成多己胺神经元，且神经元细胞的基本功能不受影响。目前，除了小鼠和人的ｉＰＳ细胞，猴、大鼠和猪的ｉＰＳ细胞也己成功建立＾｜＂ｗ。我国干细胞研究发展迅速ｉＰＳ２００８，在研究的多个领域也取得了重大突破。＂Ｉ年邓宏魁研究组首次报道建立了恒河猴ｉＰＳ细胞系，第二年该小组成功地将人ｉＰＳ细胞高效的分化成能分泌肤岛素的成熟膜岛细胞。又成功地将人ｉＰＳ细胞Ｗ分化成肝细胞。２００９年中国科学院生化细胞所肖磊研究员的实验室报道建立了１１？大鼠ｉＰＳ细胞系和猪ｉＰＳ细胞系气裴端卿教授的实验室也报道建立了西藏小型猪的ｉＰＳ细胞系。由于猪的许多生理指标更接近于人类，因此这两项研究具有极＂大的应用前景，。中国科学院健康科学研究所金颖研究员的实验室发现利用人成纤维细胞作为滋养层细胞在不添加白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ，化ｃｔｏｒ，ｌｉｆ）的情况下，可Ｗ诱导神经前体细胞重编程为ｉＰＳ细胞。１１月Ｉ该课题组一ＰＳ利用人羊水来源的细胞作为重编程的起始细胞报道了ｉ细胞，种高效快速建立ｊ系的方法。２００９年９月，中国科学院北京生命科学研究所高绍荣研究员的实验室’’－－成功建立了型地中海贫血病人的ＰｉＰＳ细胞系，为该病发病机制的研究、治疗药物的筛选及细胞移植治疗提供了有力的工具。同年，该小组和中国科学院动物研一究所周琪研究员的课题组同时报道获得了世界上第次获得完全由ｉＰＳ细胞制备的活体小鼠，有力地证明了ｉＰＳ细胞具有真正的全能性。７１ 解放军医学院博＋学位论文２ＩＰＳ细胞与肝脏疾病研究２．１ｉ巧细胞分化为肝细胞的方法Ｕ５＇２６ｉＰＳ细胞分化为肝细胞系已在鼠哺人细胞中通过应用类似作用于ｈＥＳＣ－细胞的的方式得到实现。ＳｉＴａｙｅｂ等发现，ｉＰＳ细胞分化出的化胎与对照的包含一肝细胞、内皮细胞和窦间隙细胞的胎儿肝细胞相似，可Ｗ与对照的肝脏样表达同样水平的特定的基因和标志物。此外，他们发现人类的包皮成纤维细胞通过０ＣＴ３ｉＰ／４，Ｓ０Ｘ２，化ｎｏｇ和ＬＮ２８的慢病毒转导所产生的Ｓ细胞具有向肝细胞分化的能力，，这些，可通过四个步骤在低氧的环境下实现。他们证明细胞移植体内在小ｔｗ鼠胎巧细胞可增殖７天。ＳｏｎｇＺ等报道人的ｉＰＳ细胞向功能性肝细胞的分化可能为多阶段的过程，６０％产生ＡＦＰ和白蛋白，与ｈＥＳＣ分化为巧细胞类似ｎＳｕｌ１ｉｖａｎ－ＭＨ个人ＰＳ等通过逆转录病毒诱导的日ＣＴ４，Ｓ０Ｘ２，化Ｆ４和ｃｙｃ获得了ｉ细胞系。＝，他们发现，所有这个细胞株可Ｗ分化为具有白蛋白和上皮细胞巧粘蛋白的产生＂Ｗ－表达甲胎蛋白，肝细胞核因子４Ａ和细胞色素Ｐ４５０７Ａ１表达为特点的肝胚层。一进步的研究证明ｉＰＳ细胞在体内有分化成有功能的肝细胞的能力Ｒａｓｈｉｄ。等从ａ１抗膜蛋白酶缺乏症１ＡＴＤ、１Ａ型ＧＳＤｌａ、（Ａ）糖原累积病（）家族性高胆固－醇血症病人、１型ｃｒｉｇｌｅｒｎａａｒ综合征、和遗传性高酪氨酸血症病人的成（即）ｊｊ纤维细胞中获得ＰＳ细胞，Ｓ细，并ｉ然后ｉＰ胞系通过Ｈ个步骤分化为肝细胞表型且具有相应的疾病表型的具体属性。Ｅｓｐｅｊｅｌ等将野生鼠的ｉＰＳ细胞转染入延胡一索醜乙酌乙酸水解酶（ＦＡＨ）缺陷鼠（种人酪氨酸血症１的模型），用来说明ｉＰＳ细胞在体内具有发展为肝细胞的能力，并且可レッ保护ＦＡＨ缺陷鼠使其免于发展为肝衰竭。为了这个目的他们通过表达０ＣＴ４，Ｓ０Ｘ２，化Ｆ４和Ｍｙｃ基因的质粒重复转染小鼠胚胎成纤维细胞而获得ｉＰＳ细胞。由此产生的ｉＰＳ细胞中没有外源ＤＮＡ整合，消除了未来激活基因的表达可能导致肿瘤的形成或不正常的细胞功能的风险。一然后ｉＰＳ细胞注入到ＦＡＨ缺陷囊胚产生些嵌合子的后代。由于ＦＡＨ缺陷鼠来源－－－－－－二的肝细胞需要药物２口硝基４甲横醜苯甲醜）１３（ＮＴＢＣ）才，环己丽能生存，ＮＴＢＣ去除后，少数来自野生ｉＰＳ细胞的肝细胞可Ｗ取代这些动物的整个肝ＮＴＢＣＰＳ脏。，在去除后因此，所表现的嵌合子的后代和ｉ衍生细胞发生近乎完全７２ 解放军睦学院博＋学位论文的肝细胞的再生不是由于细胞融合的结果。具有ｉＰＳ衍生嵌合子肝脏的动物可免于出现与ＮＴＢＣ缺乏引起的肝衰竭。重要的是，ＩＰＳ源性肝细胞能够与原发性肝一样具有相同的效率来响应出生后的巧损伤细胞。如果多能干细胞可Ｗ应用于再ＰＳ生医学，这个发现是尤为重要前。这个研究清楚地阐明ｉ细胞在体内可发生具有完全功能的体细胞。通过体外分化的人类ｉＰＳ源性巧细胞转染实验动物，可Ｗ应用ｉＰＳ细胞技术来研究人类疾病。２．２ｉＰＳ细胞遗传代谢性疾病模型建立许多用来了解疾病的病理生理机制的动物模型是通过基因改造产生的，在人和动物的生物和生理上的差异限制了送些模型在临床上的应用，并且也可能至少＂２１ＰＳ是部分临床实验失败的原因。通过分化的病人的ｉ细胞成为疾病的体细胞来复制人的疾病可Ｗ提供关于疾病的更全面的新的信息，使对疾病的病理生理机制的研究更有意义。已经从许多神经系统疾病和青少年糖尿病病人中获得ｉＰＳ细胞＂３１ｉＰ。因为肝脏是许多代谢过程的起始器官，从遗传代谢性疾病病人中获得Ｓ细－胞，并且将其分化为肝细胞受到特别关注。通过移植ｉＰＳ产生的人肝细胞形成人鼠肝脏嵌合体的动物模型可Ｗ被用于证明许多主要在肝脏代谢异常的遗传性疾病可能会导致肝脏和／或肝外疾病，。从长远来看从个别病人的体细胞产生肝细胞可能提供了不需要免疫抑制的体外基因治疗的平台。２．３ＩＰＳ细胞在未来的肝细胞替代治疗中可能具有重要的意义。各种原因所致的巧脏功能不全与肝功能衰竭严重威胁着人类的健康，病死率高ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｉｖｅｒ，ＢＡＬ，。目前认为最理想的人工肝为生物人工肝（）它不，，仅具有解毒功能由于引入肝细胞，尚具有代谢和合成能力但目前全世界尚未一套成熟的生物人工肝装置上市发展受限的瓶颈问题就是肝细胞来源问题有。，其巧ＳＣ与胜胎干细胞同样具有自我更新、增殖和分化的全能性，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍，可避免目前常用的异种及肿瘤肝细胞应用于生物人工肝的主要缺点，可能成为治疗终末期肝衰竭新的细胞来源。理一论上，可Ｗ从同个病人身上获得ｉＰＳ细胞，并用于器官移植或基因治疗。尽管己知的发生信号是如何精确的调控肝细胞的机制尚不清楚，但在脏胎发育过程中７３ 解放军隆学院博＋学位论文激活的信号途径和他们的交互作用的细节的研究是可行的。ｉＰＳ分化为肝细胞的第一一Ａ－步是应用激活蛋白诱导确定的内化层生成。进巧的应用ＢＭＰ４和ｂＦＧＦ处理１＾＾可直接使细胞向肝细胞分化，ＰＳ。目前Ｗｉ为基础的细胞治疗已经建立了许多动物病理模型，并获得了令人鼓舞的结论，并且人源的ｉＰＳ细胞己经证明可和ＥＳＣｓ一一样具有向肝细胞系分化的潜质。尽管仍存在些局限性（如形成崎胎瘤的风险），ｉＰＳ分化的肝细胞应用于肝脏疾病的治疗仍是很有希望的。综上所述，ｉＰＳ衍生的肝细胞在研究代谢性肝病的病理生理学，发现新的药物和制定再生组织的策略方面有巨大的应用潜能ｉＰＳ。分化的肝细胞应用于肝脏疾病的治疗仍是很有希望的ｉＰＳ。通过分化的细胞衍生的人肝细胞转染到实验动物中一是否可Ｗ表达类似水平的功能还需要进步的研究，。为了构建人类疾病模型就＂＂需要具有人源细胞同样功能和分裂能力的人源化的与原代的肝细胞的嵌合体细胞。毫无疑问，，，严峻的挑战仍然存在然而，在不远的将来通过大量的创新ｉＰ研究者的努力，在Ｓ细胞技术研究方面的进展会提高我们对肝脏疾病的了解，开发新的治疗措施。参考文献１．ＴａｋａｈａｓｈｉＫＹａｍａｎａｋａＳ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏ打ｏｆｌｕｒｉｏ１：ｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅｅｍｂｒｏｎｉｃ’ｐｐｙ＇ｔ－ａｎｄａｄｕｌｔ加ｒｏｂｌａｓｔｃｕｌｔｕｒｅｓｂｄｅｆｉｎｅｄｆａｃｏｒｓ．Ｃｅｌｌ２００６１２６４：６６６７６ｙ，３．，（）２ＴＫＴｔ．Ｉ．ａｋａｈａｓｈｉａｎａｂｅＫＯｈｎｕｋｉＭｅａｌｎｄｕｃｔｉｏ打ｏｆｌｕｒｉｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｓｏｍ’’ｌｆｒ，ｐｐ－ａｄｕｌｔｈｕｍａｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｂｄｅｆｉｎｅｄｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ２００７１３１５８６１．：８７２ｙ，，（）ＭＡ－３．ＹｕＪＶｏｄａｎｉｋＳｍｕａＯｔｔｏＫｅｔａｌｌｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｌｉｎｅｓｄｅｒｉｖｅｄ，ｙ，ｇ，ｐｐ－．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００７３１８５８５８１ｆｒｏｍｈｕｍａｎｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓ：９１７１９２０．，，（）４ＺｈＹＬＷＬｖ文ｔ．ＰＳ．ａｏＸｉｅａｌｉｃｅｌｌｓｒｏｄｕｃｅｖｉａｂｌｅｍｉｃｅ化ｒｏｕｈｔｅｒａｌｏｉｄ，，ｔ，ｐｇｐｃｏｍｌｅｍｅｎａｉｏｎＪＮａｔｕｒｅ２００９４６１－ｔｔ：ｐ．７２６０％９０．，［］，（）５．ＫａｎＷａｎＪａ打Ｙｅｔａ．ｉＰｃｅｌｌｓｃａｎｓｕｔｔｍｅｎｔｇＬｌＳｏｒｆｂｌｌｅｒｍｄｅｖｅｌｏｏｆ，ｇＺｈｇ，，ｐｐｐｔｅｔｒａｔ－ｔＣｔ２００９－ｌｏｉｄｂｌａｓｔｏｃｓｃｏｍｌｅｍｅｎｅｄｅｍｂｒｏｓ．ｅｌｌＳｅｍＣｅｌｌ５２：１３５１ｐｙｐｙ口，，３８．］（）６ＢＭＪＨＬｔ．Ａｔ．ｏｌａｎｄａｚｅｎＪＮａｚｏｒＫＬｅａｌｄｕｌｔｍｉｃｅｅｎｅｒａｅｄｆｒｏｍｎｄｕｃｅｄ，，ｉ，ｇ－ｌｕｒｉｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓＪ．Ｎａｔｕｒｅ２００９４６１７２６０：９１９４．ｐｐ，［］，（）７４ 解放军医学院博＋学位论文ＫＮＫＰａＡｅ－ｆｉ化ｎｃａｎｄｓｕｂｓｅｕｅｎｔ７．Ｋａｉｏｒｒｂｃａｔａｌ．Ｖｉｍｓｆｒｅｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｌｕｒｏｙｑｊ，ｐｐ’ｙ’７７１－７７５ｉｎｔｏｒｓＮａｔｕｒｅ２００９４５８７２３９．ｅｘｃｉｓｉｏｎｏｆ：ｒｅｒｏｒａｍｍｇｆａｃ．ｐｇ，，（）＾ｔｒｔｏｒａｍｓｔａｌ．ｉＢａｃａｎｓｏｓｉｉｏ打ｒｅｒ８．ＷｏｌｔｅｎＫＭｉｃｈａｅｌ巧ＭｏｈｓｅｎｉＩｅｇｊ，ｐｇｇｙｐｐ，７６６＿７７０ｆｏｂａｓｔｓ１：ｏｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ２００９４５８７２３９：．ｉｂｒｌｐｐＤ，，（）’ｔ－ＤＢＣｌｉ＜ｕｃｅｄｔｒｋｉｎｓｏｎｓｄｉｓｅａｓｅａｉｅｎ：ｄｅｒｖｅｄｉｎｉ９．ＳｏｌｄｎｅｒＦＨｏｃｋｅｍｅｅｒｅａｒｄｅａｌ．Ｐａ，，ｐ，ｙｌｕｒｉｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｅｅｏｆｖｉｒａｌｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇｐｐ９６４－ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ２００９１３６５：９７７．，，（）ｏ化ｎｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍａｄｕｌｔ１０．ＬＨＺｈｕＦＹｏｎＪ巧ａｌ．ｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｔｉｕＧｅ，，ｇ，ｐｐ－ｅｒｏｌａｓｔｓ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ．２００８３６：５８７５９０ｒｉｉｅｓｕｓｍｏｎｋｙｆｉｂｂ．；（）１ＣｕｉＣｈｅ打Ｓｅｔａｌｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｌｉｎｅｓｆｒｏｍ１．ＬｉａｏＪＣ．Ｇ，，，ｐｐ４１１１－１５ｔｔｌＪＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅ．ａｄｕｌｌ２００９：ｌｒａｃｅｌｓ．，，（）［］ＭＡｔｒｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｌｉｎｅｓ１２．ＥｓｔｅｂａｎＸｕＪＹａｎＪｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｒａｉｏｎｏｆｉｎｄｕｃｅｄｌｕｉｐ，ｇ，ｐ，２８４２６－ｔＪ１７６３４１７６４０．ｆｒｏｍｔｉｂｅｔａｎｍｉｎｉａｕｒｅｉ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２００９：ｇ，，（）ｐ［］ＣｈＪ民ｅｎＪｅｔａＧｅｎｅｒａｔｉｄｉ化ｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｗＵｈａ１３．ＷｕＺｅｎｌ．ｉｏｎｏｆｉｎｄｕｃｅｌｕｒｏｎ，，，ｐｇｐｐ－－ｓｓｅｍＪＪＭｏＣｅｌｌＢｉｏ２００９ｌｌ４６５４ｄｒｕ：．ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｙｔｌ，）ｇ，（［］ＹＪｅｔａｔｔｓｔｓｆｒｏｍａｄｕｌｔ１４．ＬｕＨＳＺｈｕＦＦｏｉｉｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏ打ｏｆｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｏｅｎｅｍｃｅｌｌｉ，，ｐｐ，ｇ３５８７—５９０ｋｔｓＣｌＳｔｅｍＣｅｌ．ｒｈｅｓｕｓｍｏｎｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｌ２００８：．ｅｌ，ｙ，（巧ｈＪｉａＷＬｉｕＭｔＨｉｈｌｅｆｆｉｃｉｅｎｔｄｉ瓶ｒｅｎｔｉａｔｉｏ打ｏｆｈｕｍａｎＥＳｃｅｌｌｓ１５．ＺａｎＤＨｎｅａｌ．ｇ，ｇ，，ｇｙｉ－ｃｎｃｅｓａｎｄ巧ｌｔｅａｎｃｒｅａｔｃｉｎｓｕｌｉｎｒｏｄｕｉｌｌ．ＣｅｌｌＳｃｅｌｓｉｎｏｍａｔｕｒｐｐｇ民ｅｓ２００９１９４：４２９＾３８．，，（）ｔｔｅ－ＨｋｅｃｅＬｉｕＹｅｎｔｅｎｅｒａｔｉｏ打ｏｆｈｅａｏｃｌｌｓｆｒｏｍ１６；Ｘｌ．Ｅ．ＳｏｎＺＨＣａｉＪｅｔａ饭ｄｐｙｇ’ｇ，，２３３－１２４２ｉｋｎｔｌ．ｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄ．ＣＲｅｓ２００９１９ｌ１：１ｌｕｒｏｓｔｅｍｃｅｌｓｅｌｌ，ｐｐ，（）ＷＬＳｔＧｔｉｒａｔａｎｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｏｔｅｎｔｓｔｅｍ１７．Ｌ＾ＷｅｉＷＺｈｕｅａｌ．ｅｎｅｒａｏｎｏｆｄｈｕｍａｎｉ，乂ｐｐ，ｉｔｉｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．ＣｅｌｌＳｔｅｍｃｅｌｌｓｂｃｏｍｂｉｎｎｇｇｅｎｅｉｃｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｎｇａｙＣ２００９４－ｅｌｌ１：１６１９．，，（）ｒｏｓｔｅｍｃｅｌｌｓｗｉ化ａ１８．ＷｕＺＣｈｅｎ化民ｅｎＪＴｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｉｉｎｄｕｃｅｄｌｕｉｐｋｎｔ，ｇｐ，ｐ－－ｅｓｓｅｍｌｌ４６５４ｄｒｕ．！ＭｏＣｅｌｌＢｉｏｌ２００９：．ｉｎｄｕｃｉｂｌｙｔｌ，ｇ，（）７５ 解放军医学院博＋学位论文１９．ＥｓｔｅｂａｎＭＡＸｕＪＹＹａ打ＪＹｅｔａｌｅｎｅｒａ打ｏｆｉｎｄｕｃｅｄｓｅｍｃｅ．Ｇｔｉｏｌｕｒｉｏｔｅｎｔｔｌｌｌｉｎｅｓ，，ｇ，ｐｐ－ｆｒｏｍＴｉｂｅｔａｎｍｉｎａｔｕｒｅ．Ｂｉ２００９２８４２６：７６３４１７６４０．ｉｉ呂ＪｏｌＣｈｅｍ１，，ｐ（）－２０ｉＭａｔＧ－ｔｂｎｔｔｌ．ＬＣＬＹｕＨＹｅａｌ．ｅｒｍｌｉｎｅｃｏｍｅｔｅｎｍｏｕｓｅｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｏｓｅｍｃｅｌ，乂，ｐｐｐｎｅｓｅｎｅｒａｅｄｏｎａｎｒｏｓｗｉｔｈｏｕｔｅｘｏｅｎｏｕｓｅｕｅｍａｏｒｌｉｇｔｈｕｍｆｉｂｂｌａｔｓｇｌｋｉｉｎｈｉｂｉｔｙｆａｃｔｏｒ．ＰＬｏＳＯｎｅ２００９４８７２４：ｅ６．，，（）２１．Ｌｔ．ＰｔｔｄｉｎｉＣＬＺｈｏｕＪＭＳｈｉＧＬｅａｌｌｕｒｉｏｅｎｃｃａｎｂｅｒａｉｄｌａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｌｉｎｄｕｃｅ，，，ｐｙｐｙｙａｎａｍｎｏｔｃｕ－＾３４ｈｕｍｉｉｆｌｉｄｄｅｒｉｖｅｄｃｅｌｌｓ．ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ２００９１８２２：４３４０９．，，（）２２ＷａｎＹＸＪｉａ打ＬｕＳｅｔａｌＧｅｎｅｒａｔｉｏ打ｏｌｕｒｏｔｅ打ｔｔｅｍｃｅｌｌｓｍ．ｇｇＹＨｉ．ｆｉｎｄｕｃｅｄｉｓｆｒｏ，ｐ，ｐ－化－ｈｕｍａｎａｉｔ．Ｃ民２００９１９９１１２１１２ｌａｓｓｅｍａ前ｒｏｂｌａｓｃｅｌｌｓｅｌｌｅｓ：０３Ｐ，，（）２３．ＺｈａｏＸＹＬｉＷＬｖＺ，ｅｔａｌｊＰＳｃｅｌｌｓｒｏｄｕｃｅｖｉａｂｌｅｍｉｃｅ化ｒｏｕｈｔｅｔｒａｌｏｉｄ，，ｐｇｐｔ—９０ｃｏｍ．ｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｒＬＮａｕｒｅ２００９４６１７２６０：％ｐ，，（）２４－ｍｅｎｔｏｆ．ＫａｎｇＬＷａｎａｎｅｔａｌ．ｉＰＳｃｅｌｌｓｃａｎｓｕｏｒｔｆｌｉｌｌｔｅｒｍｄｅｖｅｌｏ，ｇＺｈｇ乂ｐｐｐｔ－—ｅｔｒａｌｏｉｄｂｌａｓｔｔｔｔ２００９５：ｏｃｓｃｏｍｌｅｍｅｎｅｄｅｍｂｒｏｓ．ＣｅｌｌＳｅｍＣｅｌｌ５２：１３１３８．ｐｐｙ，ｙ，（）２５．ＧａｉＨ，ＮｇｕｙｅｎＤＭ，ＭｏｏｎＹＪ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｍｕｒｉｎｅｈｅｐａｔｉｃｌｉｎｅａｇｅｃｅｌｌｓ化ｎｔｔ－ｆｒｏｍｉｎ加ｃｅｄｌｕｒｉｏｓｅｍｃｅ．Ｄｔｔ．２０１０７９３１７１１８１．ｌｌｓｉｆｆｅｒｅ打ｉａｉｏｎ：ｐｐ；（）２６．ＬｉＷＷａｎＤｉｎＪｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｈｅａｏｃｔｅｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅ，ｔ，ｇ，Ｑｐｙｔｔｔｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｐｏｅ打ｓｅｍｃｅｌｌｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌｕｌａｒＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．ｐ２０１０２２２３－：４９２５０１．；（）２７－．ＳｉＴａｅｂＫＮｏｔｏＦＫａａｏｋａＭｅｔａｌＨｉｆｉｔｔ．ｈｌｅｆｃｉｅｎｅｎｅｒａｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｙ，Ｎ，，ｇｇｙｇｈｅａｔｏｃｔｅ－ｃｔｔｙｌｉｋｅｅｌｌｓｆｒｏｍｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｏｅｎｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，ｐｐｐ－２０１０５１１：２９７３０５．；（）２８ＺＣａＪＬｉｕＹｅａＥｆｉｃｅｎｔｅｎｅｏｎｏｆｅａｔｏｃ－ｓ．Ｓｏｎｇｉｔｌ．ｆｉｒａｔｉｈｔｅｌｉｋｅｃｅｌｌｆｒｏｍｈｕｍａｎ，，，ｇｐｙ－ｔｔｓｔｅｍＲ．２１９ｌｌ１２３１２４２ｉｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｏｅｎｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌｅｓｅａｒｃｈ００９；３．ｐｐ；（）２９．ＳｕｌＪＨＤＣＰＩＨｔＧｔｔｌｉｌｉｖａｎＧａａｒｋｅａｌ．ｅｎｅｒａｉｏ打ｏｆｆｔｉｎｃｉｏｎａｈｕｍａｎｈｅａｔｃ，ｙ，，ｐｅ打ｄｏｄｅｒｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｕｒｉｃｔｔｌＨｔｆｒｏｍｈｕｍｐｌｐｒｔｅｎｓｅｍｃｅｌｓ．ｅｐａｏｌｏｇｙ．－２０１０５１ｌ：３２９３３５．；（）３０民ｕＬＬ．ＳｔｌｌｄｔｉｉＣｌ．．ｂｉｎｅｍｃｅｓａｎｄｄｒｕｇｉｓｃｏｖｅｒｙ：ｈｅｂｅｇｎｎｎｇｏｆａｎｅｗｅｒａ？ｅｌ７６ 解放军医学院博＋学位论文２００８１３２－：５４９５５２．；３１－．ＫｎＥＥＫ．Ｐｔｔｔｉｓｋｉｉｓａｎｒｏｒｅｓｓｏｗａｒｄｈｅｃｌｉｎｉｃａｌａｌｉｃａｉｏｎｏｆａｔｉｅｎｔｓｅｃｉｆｉｃ，ｇｇｇｐｐｐｐ－ｉＪＣｉＩｔ１２０５１５９ｐｌｕｒｐｏ化ｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｌｎｎｖｅｓ．：．３２．民ａｓｈｉｄＳＴ，ＣｏｒｂｉｎｅａｕＳ，ＨａｊｉｎａｎＮｅｔａｌ．Ｍｏｄｅｌｉｎｉｎｈｅｒｋｅｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｄｉｓｏｒｄｅｒｓｏｆ，ｇ化ｅｌｉｖｅｒｕｓｉｎｇｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏ化ｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．２０１０１２－０９：３１２７３１３６．；（）Ｍ－３３．ＥｓｅｅＳ民ｏＧ民Ｌａｕｅｔａ．Ｉｔｔｔｐｌｉｌｃｈｌｉ打ＫＪｌｎｄｕｃｅｄｌｕｒｉｏｅｎｓｅｍｃｅｌｌｄｅｒｉｖｅｄｊ，，ｇ，ｐｐｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｈａｖｅ化ｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓｎｅｅｄｅｄｆｏｒｌｉｖｅｒｉＪＣｌＩｔ２０１０１２０９３１２０－３１２６ｒｅｎｅｒａｔｏｎ．ｉｎｍｉｃｅ．ｉｎｎｖｅｓ．：巧；（）３４．ＺａｒｅｔＫＳＧｒｏｍｅＭＧｅｎｅｒａｉｏｎａｎｄｒｅｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｓｏｆｔｈｅｌｉｖｅｒａｎｄａｎｃｒｅａｓ．ｔ．，ｐｇｐ－Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８３２２５９０７：１４９０１４９４．；（）７７ 解放军医学院博＋学位论文攻读学位期间发表文章情况１王建军，赵平，斬雪源，Ｔ宁，卿松，程勇前．老年急性和亚急性肝炎的病因－．中华实验和临床感染病杂志（电子版）：及预后关系的研究，２０１２６１２４２６，（）２王建军，荣义辉，斩雪源，程勇前，卿松，罔涛，Ｔ宁，赵平，辛绍杰．特发性口脉高压症２０７６４３－１１例临床特点分析。人民军医，１２巧（）：６４４，３王建军，斬雪源，赵平。靴向药物治疗在肝脏疾病中的应用。中国肝脏病杂志４－（电子版２０１２３：５１５６），，（）４王建军，赵平。老年ＨＣＶ感染者抗病毒治疗研究进展。实用肝脏病杂志，２０１２１５，４６３－４６５（５）：’’’５王建军万志红辛绍杰赵平。诱导性多能干细胞与肝脏疾病研究相关进展。中－华实验和临床感染病杂志，２０１３７（２３０３３０５，）：王建军－６，万志红ｔＴＡＴＯＣＴ４，赵平，斬雪源，谢国明，辛绍杰。Ｔａ融合蛋白表达载体２０－的克隆化及蛋白表达研究１３３４（８８６１８６４。解放军医学院学报。，）：７－，斩雪源，谢国明，辛绍杰ｔＴＡＴ王建军，万志红，赵平。化融合蛋白表达载体Ｓ０Ｘ２－的克隆化及蛋白表达研究２０１４２８（５）；３５２３５４。中华实验和临床病毒学杂志。，８－，，赵平，斬雪源ｔＴ王建军万志红，谢圉明，辛绍杰。化融合蛋白表达载体ＴＡｃｍｙｃ－的克隆化及蛋白表达研究２０１５９（日）：７８８７９２。中华临床医师杂志。，９王－建军，，赵平，斩雪源，ａｔ万志红谢国明，辛绍杰。Ｔ融合蛋白表达载体ＴＡＴＫＬＦ４－的克隆化及蛋白表达研究２０１５２９２；１８０１８２。中华实验和临床病毒学杂志。，（）７８ 解放军隆学院博＋学位论文致谢博±的工作学习生活即将结束了，与所经历的硕±研究生阶段相比，再次的体验了科学研究的艰辛，也再次获得了不菲的收获，在这里，首先要感谢对我的这几年的研究和生活付出也血与辛勤汗水的导师辛绍杰教授、貌脉勇教授。导师严谨的治学态度，对科学的孜孜不倦的追求，，对学尘的无微不至的帮助使我在这几年的学习生活中对科学研究再次有所斩获，在科学的道路上可Ｗ继续前进。。。科学上没有平坦的大道在这几年的科学研究中，曾经也有过挫折在实验不一一顺利的时候，是导师和我起分析，寻求解决的办法，终于攻克了个个技术难题，使得我的论文得Ｗ完成。在生活中，导师既是良师，又是益友。他Ｗ其独特一的人格魅力，讫释出个科学家所应具有的科学的品质，正。可＾说是由于导师一无私的帮助，句话，！才使我能得Ｗ顺利完成学业：导师衷也感谢您。总之感谢万志红副研究员对我的课题工作的设计、具体实施的指导。还要感谢国际肝病科的赵平主任，在科室人员紧工作任务重的情况下毅然同，意我的求学要求，并积极创造有利于学习的工作、生活条件，使我的学业可Ｗ顺利完成。也要感谢国际肝病科斩雪源主任医师、程勇前副主任医师、罔涛副主任医师及全科的医护人员在我学习期间对我的科研工作的大力支持。感谢李瑞生副研究员、吴怡琢博±在动物实验方面的支持。最后要感谢谢国明、王志杰及实验保障中必的各位同仁，谢谢他们在各项实验的准备工作中所付出的辛勤努力。一临近毕业之时！，我在送里祝所有关也、帮助我的人们，化平安７９
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