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1、射频肝损伤血清诱导兔骨髓干细胞向肝细胞样分化作者：杨屹，张明宇，屈波，霍建华，王作仁【摘要】目的:观察射频肝损伤血清能否诱导自体骨髓间充质干细胞（MSCs）向肝样细胞分化,以寻求一种自体肝组织的修复方法.方法:射频治疗灭活40%兔肝脏组织,于36h后取全血及骨髓.用体外细胞培养技术从骨髓血中分离、纯化兔骨髓MSCs后,于自体射频肝损伤血清中培养,流式细胞仪测定细胞周期并观察其增殖及生长特征,免疫荧光法鉴定细胞性质及功能.结果:原代、传代培养及流式细胞仪结果显示,兔骨髓MSCs具有活跃的增殖能力,并在射频肝损伤血清诱导下向肝样细胞分化.2wk后免疫荧光染色
2、可见分化后细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白.结论:射频肝损伤兔血清可促进自体骨髓MSCs增殖并向肝样细胞诱导分化,在射频治疗同时行肝样细胞移植修复肝损伤具有可能性.【关键词】射频消融；肝损伤；骨髓间充质干细胞；肝样细胞 0引言10 射频消融(radiofrequencyablation，RFA)是近年来肝脏外科的一项新技术.对小肝癌治疗效果基本同手术治疗，应用较广,治疗范围逐渐扩大,但同时肝功能损害问题也明显增多.肝损害可激活机体修复功能,产生、释放的多种因子对骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)有诱导分化作用［
3、1］.利用RFA治疗引起的肝损伤激活MSCs向肝细胞样分化,体外扩增后于再次RFA治疗完成时，经射频治疗针注射通道注入治疗灶周围，或用于RFA治疗时同种异体细胞移植.由于治疗灶的组织框架及对机体持久刺激作用,有利于植入的肝样细胞趋化损伤区域，爬行替代.可使RFA治疗范围扩大同时减少肝功能损害. 1材料和方法 1.1材料健康新西兰大白兔36只(西安交通大学医学院动物试验中心),2～3mo龄，雌雄不限，体质量1.5～2.0kg；低糖DMEM液体培养基，标准胎牛血清（fetalcalfserum，FCS），4℃保存备用(美国Hyclone公司)；荧光显微镜
4、,CO2孵箱(上海Heraeus公司)；SWCJIFD型超净工作台，流式细胞仪(美国BECTONDICKINSON公司)；细胞荧光标记物(武汉博士德生物制剂公司)；RF2000型射频机及10尖锚状电极(美国Radiotherapeutic公司)；Tcssp2型激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司). 1.2方法 1.2.1RFA射频肝损伤模型建立及治疗血清制备将兔背部脱毛,置电极板于背部脱毛区,40mg/kg氯胺酮、12.5mg/kg氯丙嗪全身麻醉,无菌条件下开腹暴露肝脏,分别置电极针于肝叶中心,展开电极针控制其直径为20mm,射频仪起始功率
5、为3W,逐渐增加达30W,约10～13min阻抗达100%时功率自动降为0停机,灭活肝组织总体积40%,连续缝合关腹,给于抗感染治疗.于术后36h经颈动脉插管取全血,室温静置1h,离心提取血清,-20℃保存备用.10 1.2.2兔骨髓BMSCs的分离取新西兰大白兔，用40mg/kg氯胺酮经耳缘静脉麻醉；无菌操作下以12号骨髓穿刺针刺入兔胫骨骨髓腔，接10mL注射器(内含3×106U/L肝素0.2mL)，抽取骨髓5mL；加入盛有同体积比重1.073/mL淋巴细胞分离液的试管中，1500r/min离心20min,用吸管吸取中间的乳白色有核细胞层，进行原代培
6、养接种. 1.2.3兔骨髓MSCs的原代培养和传代培养将经上述培养分离所得的有核骨髓细胞按1×106个接种于25mL培养瓶内,进一步差速贴壁弃去未贴壁细胞后加入低糖DMEM全培养液(含100mL/L胎牛血清),于37℃，50mL/LCO2饱和湿度条件下静止培养；于接种3d后进行第1次换液,以后隔日换液.原代培养至贴壁细胞铺满整个培养瓶底部,用2.5g/L胰酶液将贴壁细胞消化分离(37℃,3～5min).按1∶2比例进行传代接种培养. 1.2.4射频肝损伤治疗血清对兔骨髓MSCs的诱导作用将P2MSCs细胞分为三组,在不同条件下培养诱导.①对照组：含1
7、00mL/LFCS的低糖DMEM培养液；②RFA肝损伤治疗血清组(RFA组)：无血清低糖DMEM培养液加入终浓度为300mL/L射频肝损伤兔治疗血清；③细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)组(HGF组)：含100mL/LFCS的低糖DMEM培养液加入肝细胞HGF20μg/L及表皮细胞生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)20μg/L,每3d换液1次.细胞诱导2wk后进行鉴定.细胞培养与诱导过程中用倒置显微镜观察细胞形态,观察诱导后MSCs向肝细胞样分化的情况. 1.2.5流式细胞仪测定细胞周期2w
8、k后取以上各组细胞,2.5g/L胰酶消化,悬液离心后弃去滤液，每个样本收集约1×
