瘀胆血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究论文

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　　瘀胆血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究论文钟晓琳，万居易，王忠琼，李昌平，胡莲【摘要】目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)体外诱导其分化为肝细胞的可行性。方法分离、纯化并鉴定大鼠骨髓MSCs，制备正常及瘀胆大鼠血清，取第3代MSCs分组培养：A组：DMEM+10%FBS;B组：肝细胞生长培养基(HGM)+5%FBS;C组：HGM+5%正常大鼠血清;D组：HGM+5%瘀胆大鼠血清;E组：HGM+5%瘀胆大鼠血清+25μg/LHGF。观察各组细胞形态变化，MTT法测定细胞生长曲线.freelRNA阳性表达，第14，21天出现CK18mRNA阳性表达，D、E组上清液中白蛋白浓度随诱导时间延长逐渐升高，且E组高于D组(P0.05)。A、B、C组未见AFP、CK18表达及白蛋白浓度变化。结论正常大鼠血清能明显促进MSCs的增殖;瘀胆血清对MSCs有一定促增殖作用，且能有效诱导其向肝细胞分化，联合使用HGF能提高分化率。【关键词】瘀胆血清;肝细胞生长因子;间充质干细胞;肝细胞ResearchontheDifferentiationofMesenchymalStemCellsInducedbyChelestaticSerainvitrointoHepatocyteZhongXiaolin,edicalColleg,LuzhouCity,SichuanProvince646000P.R.ChinaAbstractObjectiveTodiscussthepossibilityofthedifferentiationofmesenchymalstemcells(MSCs)inducedbychelestaticserainvitrointohepatocyte.MethodsRatbonemarroalandcholestaticseraofratsedium(HGM)+5%FBS),GroupC(HGM+5%normalratsera),GroupD(HGM+5%cholestaticratsera)andGroupE(HGM+5%cholestaticratsera+25μg/LHGF);Themorphologicchangesoftheinducedcellseasurederasechainreaction(RT-PCR)andthealbumincontentinsupernatantinedbybromocresolgreenmethod.ResultMSCspolygonalandbinuclearcellsorphologicchangesofthecellsonstratedthatthecellsinGroupCproliferatedthefastestandthoseinGroupDandGroupEproliferatedfasterthanthoseinGroupB(P0.05);thepositiveexpressionofAFPmRNARNAinconcentrationinthese2groupsincreasedalongelengthofinduction,andtheconcentrationinGroupEinconcentrationchangesalratseracanobviouslypromotetheproliferationofMSCs;cholestaticseraisofcertaineffectinMSCsproliferationandcaneffectivelyinducethedifferentiationofMSCsintohepatocytes,thebinedapplicationesenchymalstemcells(MSCs)hepatocyte近年来的研究表明，骨髓间充质干细胞(Mesenchymalstem cell，MSCs)在一定条件下能分化为肝细胞1，这为临床上解决肝细胞移植、生物人工肝等的肝源短缺问题提供了新的思路2，但MSCs的分化方向受周围环境多种因素影响和决定，寻求适合MSCs增殖及向肝细胞定向分化的条件是目前尚需解决的重要问题。本研究采用含正常大鼠血清、瘀胆血清及肝细胞生长因子(hepatocytegroo公司，美国);倒置荧光显微镜、倒置相差显微镜(Olympus公司，日本);酶标仪(Bio-Rad公司，美国)PCR扩增仪(PE公司，美国)。1.3MSCs的分离、纯化与鉴定在无菌条件下取8～10周龄SCs用于分化及鉴定。1.4MSCs的诱导培养1.4.1制备大鼠血清取健康)成分DMEM-LG、5%FBS、地塞米松10-7mmol/L、羟乙基哌嗪乙磺酸20mmol/L、葡萄糖1g/L、半乳糖2g/L、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠10ml/L、维生素C1mmol/L、谷氨酰胺0.73g/L。1.4.3实验分组取第3代(passage3，P3)MSCs按以下分组加入培养液诱导培养：A组：空白对照组，DMEM+10%FBS;B组：HGM+5%FBS;C组：HGM+5%的正常大鼠血清;D组：HGM+5%瘀胆大鼠血清;E组：HGM+5%瘀胆大鼠血清+25ng/ml肝细胞生长因子;每3天全量换液1次，诱导培养21天。1.4.4MTT法绘制细胞生长曲线取P3MSCs按3×104/ml密度接种于96孔培养板，每孔100ul，预留空白对照组后，按以上分组培养，在培养的第0～7天，每组取3孔细胞加入MTT10ul，4h后，吸取培养液加入DMSO50ul，在微型振荡器振荡5min后，用酶标仪测出在波长为490nm对应的OD值，每组取平均值绘制生长曲线。1.5诱导后细胞检测1.5.1形态学观察倒置相差显微镜下观察诱导分化过程中细胞胞体大小、形态、核仁数目及核浆比例的变化。1.5.2甲胎蛋白(AFP)表达的检测取诱导第0，7，14，21天的各组细胞分别提取RNA后用RT-PCR法检测各组细胞AFPmRNA的表达情况(正义：5′-AACAGCAGAGTGCTGCAAAC-3′，反义：5′-AGGTTTCGTCCCTCAGAAAG-3′)。1.5.3细胞角蛋白(CK18)表达的检测取诱导第0，7，14，21天的各组细胞分别提取RNA后用RT-PCR法检测各组细胞CK18mRNA的表达情况(正义：5′-GGACCTCAGCAAGATCATGGC-3′，反义：5′-CCACGATCTTACGGGTAGTTG-3′)。1.5.4白蛋白合成能力检测 诱导后每3天收集各组培养细胞上清液，用溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白浓度。1.6统计分析采用SPSS13.0统计软件包进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，不同时间点、不同组之间的比较采用重复测量资料的方差分析，计数资料采用秩和检验，以α=0.05为检验水准，P0.05为有统计学意义。2结果2.1MSCs的分离、纯化与鉴定接种后4～6h可见部分细胞贴壁，72h可见集落形成，原代细胞形态多样，经传代培养后细胞纯度不断提高，P3细胞形态均一，呈梭形或纺锤形细胞，呈漩涡状或平行状排列(图1～2)。经成骨诱导14d后，改良钙钴法碱性磷酸酶染色阳性，成脂诱导14d后，油红O染色呈阳性，经免疫荧光染色见CD44、CD90染色呈阳性，CD45染色呈阴性反应。2.2诱导各组细胞生长曲线的测定按酶标仪测得OD值绘制生长曲线可见B组OD值于各时间点明显低于A组，差异有统计学意义(P0.05)，提示HGM抑制细胞生长;C组各时间点OD值均高于A、B组，差异有统计学意义(P0.05)，提示正常大鼠血清有明显促生长作用;D、E组OD值均高于B组，差异有统计学意义(P0.05)，提示瘀胆血清有一定的促生长作用，D、E组两者无统计学差异(P0.05)，提示二者促生长作用无明显差异。2.3诱导后细胞的观察与检测2.3.1形态学观察A、B、C组细胞形态无明显变化，保持均一的长梭形，细胞逐渐密集，出现接触抑制。D、E组细胞约6d后，出现上皮样细胞，呈三角形或不规则形，8d左右可见少量细胞分化为多角形的肝细胞样形态，胞浆丰富、核大，甚至出现双核细胞，14d后这类细胞明显增多(图3)。2.3.2AFP表达的检测结果D、E组于诱导第7、14天可见AFPmRNA的表达，通过灰度分析，可见随诱导时间延长AFPmRNA表达量逐渐降低，同一时间点，E组灰度值高于D组(图4，5)，A、B、C组未见AFPmRNA的表达。2.3.3CK18表达的检测结果D、E组于诱导第14、21天出现CK18mRNA的表达，通过灰度分析，可见随诱导时间延长表达量逐渐增高，同一时间点，E组灰度值高于D组(图6，7)，A、B、C组未见CK18mRNA的表达。图1MSCs原代培养72h(×40)图2P3MSCs培养4d(×40)图3诱导分化14d(×100)图4诱导分化7dAFP的表达情况图5诱导分化14dAFP的表达情况图6诱导分化14dCK18的表达情况图7诱导分化21dCK18的表达情况Fig.1primarycultureofMSCsatthe72ndhour(×40)Fig.2passage3 MSCsonthe4thday(×40)Fig.3celldifferentiationonthe14thday(×100)Fig.4AFPexpressionemergedinthegroupsonthe7thdayFig.5AFPexpressionemergedinthegroupsonthe14thdayFig.6CK18expressionemergedinthegroupsonthe14thdayFig.7CK18expressionemergedinthegroupsonthe21stday2.3.4白蛋白合成能力检测检测各组培养基上清液种白蛋白含量，结果如下表，可见A、B、C三组细胞白蛋白水平均无明显变化，且两两比较差异均无统计学意义(P0.05)。D、E组上清液中白蛋白含量提高，且随着时间的推移，白蛋白分泌量增加，与其余各组比较差异有统计学意义(P0.05)。E组各时间点白蛋白浓度高于D组，差异有统计学意义(P0.05)。结果表明：瘀胆血清组和瘀胆血清+HGF组能诱导骨髓MSCs合成白蛋白。表1培养基上清液中ALB的含量◆:与B组比较，P0.05，;与C组比较，P0.05，差异无统计学意义;与D、E组比较，P0.05，差异有统计学意义▲:与C组比较，P0.05，差异无统计学意义;与D、E组比较，P0.05，差异有统计学意义●：与D、E组比较，P0.05，差异有统计学意义■：与E组比较，P0.05，差异有统计学意义3讨论MSCs在体内含量很少，有效的分离、纯化骨髓MSCs是进行后续实验的基础。本实验通过密度梯度离心结合贴壁培养法分离、纯化的的细胞具有多向分化能力并符合MSCs的表面标志特点，是纯化的MSCs，是一种简单、有效、成熟的MSCs分离、纯化方法。MSCs的体外扩增是为肝组织工程提供细胞来源的前提，而组织工程种子细胞的体外扩增到组织的构建与成熟都离不开血清，为避免异种血清带来的免疫原，寻求更符合生物安全性的培养条件很有必要。StuteN等3，4研究发现10%自体血清对人骨髓MSCs的促增殖效果不亚于10%的FBS，且扩增的MSCs保持更稳定的基因表达，提示我们同种属或自体血清可能优于目前最常用的牛血清。因此，本实验中采用同种属血清培养大鼠MSCs，结果显示5%正常大鼠血清能明显促进大鼠MSCs增殖，5%的瘀胆血清有一定的促增殖作用，但瘀胆血清中含有促分化的因子会导致MSCs分化，故不宜用于MSCs的扩增。因此，我们认为正常大鼠血清能为MSCs体外扩增提供良好培养环境，可能用于MSCs的扩增，但扩增后MSCs能否保持其生物学特性尚需进一步研究证实。分化的环境是决定MSCs分化方向的关键因素。在肝脏再生机制的研究中显示，瘀胆模型中的肝干细胞能大量增殖，Avital等5采用含瘀胆血清的培养液培养骨髓β2-m-Thy-1+ 细胞，成功诱导出肝细胞表型的细胞，CaiYF等6，7的研究发现瘀胆血清能从骨髓细胞中分选出肝干细胞亚群，提示瘀胆血清可能为肝干细胞增殖及分化提供良好的微环境，但其能否诱导骨髓MSCs分化为肝细胞尚不清楚。我们采用5%瘀胆血清诱导MSCs向肝细胞分化，结果显示分化的细胞具有肝细胞形态、表型及功能，证实了瘀胆血清能诱导MSCs向肝细胞分化，可能是由于瘀胆血清含有肝脏严重损伤时代偿性产生的一系列促肝脏再生及肝干细胞分化的物质，如HGF、IL-2等，启动MSCs应答并使其向肝细胞定向分化。但是，瘀胆血清中促分化物质浓度有限，且其中还含有胆红素、胆汁酸等一些促细胞凋亡的因子，过高的浓度会导致MSCs的凋亡，所以无法通过提高瘀胆血清浓度而提高分化率。细胞因子在细胞和组织分化过程中也发挥着重要作用，国内外研究证实HGF具有诱导MSCs向肝细胞分化的作用8，另外，HGF还能减轻瘀胆型肝炎的炎症反应，减少细胞坏死及凋亡9。因此，我们选择HGF与瘀胆血清联合诱导MSCs，结果显示联合诱导能提高诱导细胞AFP、CK18的表达，提高上清液中的白蛋白水平，即提高MSCs的分化率，但HGF是通过何种途径促进MSCs的分化，目前尚不清楚。综上所述，正常大鼠血清能明显促进MSCs的增殖，5%瘀胆血清能诱导MSCs向肝细胞分化，且有一定的促增殖作用，可用于体外诱导MSCs向肝细胞的分化，联合使用HGF可以明显提高分化率，这为体外扩增并诱导MSCs向肝细胞分化提供新思路，可能为解决临床肝细胞替代治疗提供新的种子细胞来源。【