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1、肝样细胞的诱导分化及处理胆红素的能力:张永臣,许晓珣,赵伟,张亮,赵磊,文剑【摘要】目的:利用肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子4(FGF4)诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向肝细胞分化,为肝组织工程提供新的细胞。方法:取志愿者骨髓,使用密度梯度离心法联合贴壁筛选法获取MSCs,用含有HGF、EGF、FGF的培养基进行培养。用流式细胞仪、免疫细胞化学法鉴定细胞表型,检测诱导后细胞胆红素处理能力。结果:骨髓MSCs生长良好,表型为CD29阳性,CD34阴性。诱导后细胞可在21~28d时形成肝样细胞。诱导7d后细胞检测
2、到AFP的表达,第14天时CK18呈阳性表达,随着诱导时间的延长,阳性率增加,并能显著降低胆红素浓度。结论:HGF、EGF、FGF联合能诱导骨髓MSCs分化为具有处理胆红素能力的肝样细胞。【关键词】骨髓间充质干细胞;肝细胞生长因子;表皮生长因子;成纤维细胞生长因子4;胆红素肝移植是终末期肝病有效的治疗手段,由于肝源的缺乏,人工诱导的肝细胞是可供选择的可靠肝细胞;而关于肝干细胞体外分离培养的方法、肝细胞再生及其在肝脏损伤修复中的作用都尚待进一步研究[1]。因此,寻求非肝源性干细胞并促其向肝细胞定向分化是亟待解决的重要问题。骨髓间充质干细胞(MSCs)遗
3、传背景稳定,易于体外分离培养、扩增,保持多向分化潜能,在特定环境下可以分化为肝细胞。这些研究为寻找非肝源性干细胞提供了新的思路和策略。同时MSCs免疫原性低,可通过多种途径抑制同种异体免疫排斥反应,并且克服了使用胚胎干细胞和胚胎肝细胞治疗的伦理学问题,成为以干细胞为基础的肝病治疗的更好选择[2]。Okumoto等[3]体外利用肝细胞生长因子(hepatocytegroalgrol,移入含相同体积Percoll淋巴细胞分离液的离心管上层,2000r·min-1离心20min,吸取白色界面层,PBS冲洗3次,加入含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养基中
4、,调整细胞数为1×105ml-1,分别接种于25cm2规格的培养瓶,于37℃、5%CO2饱和湿度孵箱内培养,3d后换液,去掉非贴壁细胞,以后每3d换液1次。细胞长到80%~90%融合时用0.25%胰蛋白酶(用1mmol·L-1EDTANa2配制)消化,按1∶3的比例接种传代,标记为P1,传代细胞隔日首次换液,以后每隔3d换液1次,当细胞长到80%~90%融合时继续传代培养,并标记为P2,依次类推标记为P3、P4、P5等。 1.2.2骨髓MSCs表面标志的测定取第3代MSCs1×106个,加入荧光标记鼠抗人CD29、CD34单克隆抗体工作液20μl,室
5、温孵育30min,PBS洗涤2次,流式细胞仪检测细胞表面分子。 1.2.3诱导取第3代MSCs接种于6孔培养板上,按加入含HGF(20μg·L-1)、EGF(20 μg·L-1)、FGF(10 μg·L-1)的DMEM/F12完全培养液培养,定期更换培养液。在倒置显微镜下观察细胞形态的变化,分别于培养7、14、21、28d时留取细胞以备检测。 1.2.4免疫细胞化学法染色诱导培养0、7、14、21、28d时消化诱导细胞制备爬片,PBS冲洗3min,用95%酒精固定10min,PBS冲洗干净,加过氧化物酶阻断剂反应10min,PBS冲洗,3min·次
6、-1,共3次。非免疫血清封闭10min,甩弃多余封闭液。加一抗:CK18、AFP,室温反应2h,PBS代替一抗作阴性对照,PBS冲洗,3min·次-1,共3次。加生物标记的二抗10min。过氧化物酶标记的卵白素10min冲洗,DAB镜下显色,封片,普通光学显微镜下观察,计数500个细胞。 1.2.5处理胆红素取诱导21d后的肝样细胞和未诱导的hMSCs分别接种于培养瓶中,加入含胆红素的培养基进行培养,每天取少许培养上清进行总胆红素的测定(用Abbott生化分析仪进行)。 1.3统计学处理 计量资料用x±s表示,使用SPSS10.0统计软件进行统计
7、学处理,组间比较采用无重复测量设计的方差分析,两两比较采用Tukey法。 2结果 2.1骨髓MSCs培养结果及表型特征 细胞大小均匀,呈梭型、长纤维型。原代细胞生长较缓慢,15~20d铺满整个培养皿底部。传代细胞生长周期较原代细胞短,1周后细胞生长融合培养皿底达90%以上。流式细胞仪测定MSCs表面分子显示:CD29阳性率为87.92%,CD34阳性率为6.58%。 2.2诱导细胞的形态学观察 经细胞因子诱导后细胞生长速度较前变慢,细胞在21~28d时部分细胞形态由长梭形变为三角形、多角形。 3讨论 急性肝坏死、重症肝炎、肝癌等肝脏疾病进
8、展快,很快出现肝衰竭,还有遗传代谢性肝病以及终末期肝病,临床上原位肝移植无疑是理想的治疗方案,