脐带间充质干细胞诱导分化成肝样细胞的研究

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脐带间充质干细胞诱导分化成肝样细胞的研究计：学位论文：28页表格：5个插图：5幅王永霞指导教师：姜春萌教授申请学位级别：硕士学位论文提交日期：2012年4月学位授予单位：大连医科大学专业名称：内科学论文答辩日期：2012年5月学位授予日期：2012年6月评阅人：答辩委员会主席： 独雌声明嗍本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：垂丞盛签字日期：皿年上月上日 目录一、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(一)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(一)丹U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯，(二)材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8(四)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯17(六)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18三、综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20(一)综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20(二)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25四、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28 脐带间充质干细胞诱导分化成肝样细胞的研究硕士生姓名：王永霞指导教师：姜春萌教授专业名称：内科学摘要目的：通过分离人脐带问充质干细胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells，UCMSCs)，采用系列细胞因子联合诱导，探索高效可靠的体外诱导分化为肝样细胞的技术方法。方法：采用健康产妇脐带，用酶消化法分离、培养脐带问充质干细胞(UCMSC)；流式细胞仪检测细胞抗原CDl3、CD44、CDl05、CD34、CD45、HLA．DR表达情况，鉴定分离的细胞是否为UCMSCs；用肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)、成纤维细胞生长因子一4(Fibroblastgrowthfactor-4FGF一41及白细胞介素6(／nterleukin一6IL．6)进行组合分组：A组：仅基础培养基，即为阴性对照组；B组：基础培养基+HGF+FGF一4：C组：基础培养基+HGF+IL-6；D组：基础培养基+HGF+FGF．4+IL．6诱导培养第3代(P3)的脐带MSCs，用免疫细胞化学法检测细胞标志物AFP、ALB的表达情况，比较各个诱导组诱导成肝样细胞的细胞比例。数据用均数士标准差(x士s)表示，采用SPSSl8．0统计分析软件包进行分析，用单因素方差分析对资料进行统计分析。结果：1．UCMSC的细胞形态接种的UCMSC多于48小时后贴壁，5天后有短梭形细胞长出，后渐由短梭形变为细长扁平的长梭形，15天后出现梭形细胞集落，呈漩涡状或长条形生长，1月后细胞相互接触，并铺满整个培养皿底部。2．UCMSC鉴定取培养至第三代(P3)的脐带间充质干细胞行流式细胞仪检测细胞表面抗原表达，反映间充质干细胞的表面抗原CDl3、CD44、CDl05表达阳性，表达率分别为99．0％、98．4％、98．4％，而造血干细胞标志物CD34、CD45、HLA—DR表达阴性，表达率分别为4．6％、9．48％、5．04％。3．UCMSC的诱导分化3．1诱导成肝样细胞的细胞形态取培养至第三代的UCMSCs加入各细胞因子组合向肝样细胞诱导，经3-4周呈放射状的细胞排列结构逐步消失，长梭形细胞变类圆形或多角形，存在离散现象，胞浆出现颗粒，部分出现双核。3．2肝样细胞标志物表达对诱导出的肝样细胞行其标志物甲胎蛋白(AFP)及 白蛋白(ALB)检测显示：A组始终没有见到肝样细胞的标志物白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)的表达。而B、C、D组可以检测到肝细胞的标志物AFP、ALB的表达，AFP在诱导7天时，不同诱导组(B、C、D)比较，D组表达率最高；至15天时各组表达均减少，但D组仍最高；至诱导20天时各组表达均消失。而ALB在诱导7天、15天、20天都有强表达。在诱导第7天，B组表达率最高；诱导15天、20天，B、D组表达率高于C组。结论：1．使用酶消化法可以从人脐带中成功分离、培养出UCMSC。2．应用肝细胞生长因子(h印atocytegrowthfactor，HGF)、成纤维细胞生长因子．4(Fibroblastgrowthfactor-4FGF．4)及白细胞介素6(Interleukin一6IL一6)联合诱导UCMSCs可高效、稳定培养出肝样细胞。关键词：脐带问充质干细胞诱导分化肝样细胞2 Thestudyofumbilicalcordmesenchymalstemcellsdifferentiateintohepatocyte—likecellsPostgraduate：WangYongxiaSupervisor：JiangChunmengMajor：internalmedicineAbstractobjective：Toexploreaneffectivemethodofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcells(MSCs)inducedintohepatocyte—likecellsbyisolatingandinducingtheMSC．Methods：Umbilicalcordcamefromhealthypuerperant．UCMSCswereisolatedbyenzymaticdigestionandculturedfor3generation，andthentheexpressionofsurfaceantigenCDl3，CD44，CDl05，CD34，CD45，HLA—DRweredetectedbyflowcytometrytoidentifywhetherthecellsweretheUCMSC．Thepassage3(P3)UCMSCswereinducedbyHGF，FGF一4，IL一6indifferentcombinations：GroupA，onlythebasicmedium；GroupB，HGFandFGF-4putintothebasicmedium；GroupC，HGFandIL一6putintothebasicmedium；GroupD，HGF，FGF一4andIL-6putintothebasicmedium．hepatocyte-likecellmarkersAFPandALBwereexamedbyimmunocytochemistry．Damwaspresentedasmean4-standarddeviation，andanalyzedbyANOVAanalysisinSPSSl8．0statisticalanalysissoftwarepackage．Results：1．nlecellmorphologyofUCMSC：TheUCMSCwereadheredafter48hours．andfivedayslatertheshortspindlecellsgrewgraduallyintoalongslender，then15dayslatertheslendercellcolonygrowinalongstriporswiding，onemonthlatercellscontactedwitheachotherandcoveredtheboRomoftheentireculturedish．2．TheidentificationofUCMSC：Thethirdsubcultivation(Passage3，P3)oftheisolatedcellswereidentifiedbyflowcytometrytodetecttheexpressionofcellsurfaceantigen．TheexpressionrateofmesenchymalstemcellsurfaceantigenofCD13．CD44andCDl05was99．0％，98．4％and98．4％respectively，andtheexpressionrateofhematopoieticstemcellmarkersCD34，CD45andHLA—DRwas4．6％，9．48％and5．04％，implyingannegativeresult．3．Theinductionanddifferentiationofl3CMSC3 3．1Thecellmorphologyofhepatoeyte—likecells：thetllirdgeneration(P3)oftheumbilicalcordmesenchymalstemcellswereinducedbythecombinationsofcytokines．After3to4weekstheshapeofcellschangedfromlongspindleintotheroundorpolygonalform，andthecellspresenteddiscretephenomenon，thecytoplasmappearsparticles，andsomeappearedbinuclear．3．2Theexpressofhepatocyte—likecellsmarkers：GroupAdidnotexpresshepatocellularmarkersofALBandAFP，whereasothergroupswithHGF，FGF-4andIL-6showedapositiveexpressionofhepatocellularmarkersALBandAFP．AFPexpressionatthe7thdayaftertheinductioningroupB，CandD，GroupDshowedthehi曲estexpressionrate．At15thday，theexpressionratereducedinallgroups，butgroupDalsoshowedthehighestrate．Andafter20days，almostnOexpressionineachofthegroups．ALBexpressionatthe7thday，15thday，20thdayaftertheinductioningroupB，CandDhavestrongexpression．At7day，groupBshowedthehi曲estexpressionrate．At15thday，20thday，groupBandDshowedthehighestexpressionrate．Conelusion：1．HumanumbilicalcordMSCsCanbeisolatedandculturedsuccessfullywithenzymaticdigestionmethod．2．HumanumbilicalcordMSCscouldbesteadilyinducedintothehepatocyte-likecellsbythecombinationofHGF，FGF一4andlL一6invitroinhighefficiency．KeyWords：umbilicalcord；mesenchymalstemcells；induction；hepatocyte-likecell4 脐带间充质干细胞诱导分化成肝样细胞的研究硕士生姓名：指导教师：专业名称：王永霞姜春萌教授内科学刖吾针对终末期肝病，目前尚无理想的治疗手段，肝移植受到诸多因素限制不能广泛开展。近年来，几乎在所有的组织中发现了干细胞的存在。在体外特定的诱导条件下，可分化为肌细胞【11、成骨细胞[2-31、脂肪细胞141、神经细胞【51、肝细胞[61和心肌细胞【7】等多种细胞。现在研究较多的干细胞为胚胎干细胞(ESCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)，虽有大量研究显示植入此两种细胞后终末期肝病患者肝功能、凝血功能改善明显，生存质量提高，但两者都有一定的缺陷：ESCs的伦理学限制、体内成瘤性以及BMSCs数量不足和分化潜能有限的问题，这些限制了其发展。已有研究发现脐带中存在间充质干细胞，脐带间充质干细胞(Umbilicalcordmesenchymalstemcell，UCMSC)可以来源于华通胶(Wharton’SiellyWJ)18-9J、脐血及脐静脉血管内皮下【10d¨。脐带的Wharton’Sielly是一种胶状连接组织，由胶原纤维及蛋白多糖组成，含有成纤维样细胞。脐带间充质干细胞作为多潜能干细胞的一种，具有容易获得，避免了伦理道德、免疫排斥的限制，因此脐带间充质干细胞及其向肝样细胞转化的研究倍受重视，可作为肝细胞移植的来源治疗终末期肝病。但目前存在UCMSC的分离纯度，活性，产量及诱导分化等问题。本研究成功分离培养出脐带问充质干细胞，探索高效可靠的体外诱导分化为肝样细胞的方法，为终末期肝病提供可能的治疗细胞。材料和方法一、主要仪器设备及试剂1．主要仪器设备(1)3336型C02培养箱：FormaScientific产品；(2)YJ一1450型超净工作台：苏州净化设备公司；(3)PAS型流式细胞仪：德国PARTEC公司；(4)LDZ5．2全自动低速平衡离心机：北京京立离心机有限公司；(5)倒置显微镜：日本Olympusoptical公司5 (6)SK一1型37℃水浴箱：北京医疗设备厂；(7)高压灭菌器：上海田林压力表厂(8)FAl104型微量分析天平：上海天平仪器厂(9)制冰机：SIM．F124flO)202．1一S电热恒温干燥箱：上海跃进医疗器械厂2．主要试剂(1)DMEM／F12培养液美国GIBCO公司(2)胎牛血清美国IPAA公司(3)胰蛋白酶美国GIBCO公司(4)IV型胶原酶美国GIBCO公司(5)淋巴细胞分离液美国PBD公司(6)重组人肝细胞生长因子(HGF)美国PeproTech公司(7)重组人成纤维生长因子．4(FGF一4)美国PeproTech公司(8)白细胞介素一6(IL一6)美国PeproTech公司(9)藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人CD34单克隆抗体BD公司藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人HLA．DR单克隆抗体BD公司藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人CD44单克隆抗体BD公司藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人CDl3单克隆抗体BD公司多甲藻黄素一叶绿素一蛋白质复合物(PerCP)标记的鼠抗人CD45单克隆抗体BD公司异硫氰荧光素(FITC)标记的鼠抗人CDl05单克隆抗体BD公司(10)兔抗人AFP多克隆抗体北京中杉金桥公司(11)兔抗人ALB多克隆抗体美国ProteinTech公司(12)SP一羊抗兔免疫组织化学超敏试剂盒北京中杉金桥公司3．脐带本实验采用的孕妇的脐带符合以下条件：(1)脐带长度约10cm。(2)产妇发育、营养正常，正常孕周。(3)产妇无各种家族遗传性疾病、乙肝、丙肝、梅毒、恶性肿瘤等。(4)妊娠期间无严重并发症。(5)胎儿无先天性疾病。(6)家属知情同意脐带用于本实验。6 二、研究方法1．脐带的准备(1)出生后，用两个止血钳在近新生儿端和近胎盘端夹住脐带以封闭脐带。(2)剪下两个止血钳间的脐带。(3)剪下脐带后放入无菌培养基中转运至实验室，整个过程在2小时内。2．脐带间充质干细胞的分离与培养将脐带从培养基中取出，75％酒精消毒30s，D—Hank’S洗两遍，用剪刀剪成段，去除血管，D．Hank’S洗两遍，取外膜与血管之间的问充质部分，将组织剪成约O．5cm3大小，移入50ml离心管中，无血清DMEM，室温下1000rpm，离心5min洗涤1次，弃上清，加入O．1％胶原酶Ⅳ与沉淀物混匀，于37℃消化16小时，在沉淀物中加入D—Hank’S，1000rpm，离心5min，弃上清，加0．25％胰蛋白酶于37℃消化30分钟，再加入含10％血清的培养基终止，200目漏斗过滤后，再用2000rpm，离心20min，弃去上液，加入培养液重悬细胞，接种于培养瓶中。7天后首次换液，以后每4．5天换液一次，细胞长至80％融合时，0．25％胰蛋白酶(含1mmol／LEDTA)消化，传代培养。3．脐带间充质干细胞表面抗原检测细胞经传3代培养后，增殖状况稳定，行流式细胞仪检测，首先弃去培养液，用PBS洗2次，再用0．25％胰蛋白酶(含1mmol几EDTA)消化。PBS洗涤后，调整细胞1．0×106-2．0×106个／m1分为6管，每管0．5mL，分别加入鼠抗人抗体CD45．Pe疋P、CD34一PE、CDl3-PE、CD44一PE、CDl05一FITC、HLA—DR—PE，置于4。C冰箱中孵育30min，流式细胞仪检测。4．体外诱导分化选择鉴定后第3-6代增殖旺盛、活力良好的UCMSC，按1x105／ml密度接种于培养瓶内。以含有10％FBS的DMEM／F12为基础培养基。实验组分为4组：A组(对照组)：仅基础培养基培养；B组：基础培养基+10ng／mlFGF一4+20ng／mlHGF培养；C组：基础培养基+10ng／mlIL．6+20ng／mlHGF培养；D组：基础培养基+10ng／mlIL．6+20ng／mlHGF+10ng／mlFGF．4培养；每组设有3个复瓶。如表1所示，各组以相应培养液培养，以后每3天换液1次。每日在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况及形态。表l各组生长因子组合一览表7 5．免疫细胞化学检测(1)分别于诱导开始第7天、15天、20天，将贴壁的细胞用0．25％胰蛋白酶消化后，1400rpm，离心8min，PBS漂洗3次。弃上清，向沉淀内加入PBS，调整细胞悬浮密度为1．0x106-2．0x106个／ml，用多聚赖氨酸包被的载玻片作为载体，将细胞滴于载玻片上，然后晾干。(2)用4％聚甲醛固定20分钟，蒸馏水清洗3次，加O．2％Tritonxloo经过5分钟后再用PBS洗2次，封闭，加入用PBS稀释成1：100的ALB及1：200的AFP一抗覆盖细胞层，4。C冰箱过夜。(3)用PBS洗涤3分钟，重复洗3次，加入二抗工作液，置于湿盒内，于37。C恒温水浴箱中孵育30分钟，再用PBS洗涤3次，加过氧化物酶标记的链霉菌抗生物素蛋白于37℃恒温水浴箱中孵育30分钟。(4)PBS漂洗3分钟×3次后，用DAB显色法，显微镜下观察3．15分钟，流水冲洗10分钟，苏木素复染细胞核，再用流水冲洗。(5)梯度酒精脱水，在室温下风干之后，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并计数。(6)设立未诱导的UCMSCs即A组为阴性对照，用PBS代替一抗。AFP、ALB阳性结果均为胞浆内棕黄色颗粒。每组各时间点选取6张玻片，每张玻片计数高倍镜下100个细胞，计数表达阳性细胞的细胞数。6．统计学方法数据用均数士标准差(x土s)，采用SPSSl8．0统计分析软件包进行分析，用单因素方差分析对资料进行统计分析。结果1．人脐带间充质干细胞的细胞形态原代细胞生长较缓慢，接种后0～7d主要为贴壁细胞生长阶段，少数发生分裂，10d后细胞增殖明显活跃，培养15～20d可见有细胞集落生成，漩涡样或放射状排列。未形成集落的细胞长出短小的突起，随培养时间的延长，细胞集落体积逐渐增大，细胞呈长梭形、不规则形。培养1个月后细胞相互接触，并铺满整个培养瓶底部，传代24h后细胞贴壁，7天后细胞生长融合培养皿底达90％以上，以后细胞增殖活跃，每3．4天可传代。传代后的细胞体积较大，呈长梭形或不规则形。8 5d20d．J1月传代培养第3代(F3)图1脐带MSC原代培养不同时间的细胞形态(100x)2．UCMSC表面抗原表达情况如图2显示：反映脐带MSC表面标志的CDl3、CD44、CDl05表达阳性，表达率分别为99．0％、98．4％、98．4％；而造血干细胞标志物CD34、CD45、HLA—DR表达是阴性的，表达率分别为4．6％、9．48％、5．04％。说明所培养的细胞为间充质干细胞，见图2。9 ，0C{i04％J●、一矿≥，图2MSC表面抗原表达情况4詹0％王警≯3．人脐带MSC诱导分化为肝样细胞3．1细胞形态变化：在多种诱导剂作用下，人脐带间充质干细胞逐渐开始分化，诱导后7d梭形细胞开始减少，15天后细胞呈多边形，可见双核细胞，类似肝细胞形态，如图3。A组10B组+J％．％P芒‰护。；IoP00- C组D组．J图3各个诱导组诱导23d后的细胞形态(100X)3．2．免疫细胞化学染色结果分别取诱导第7天、15天、20天的细胞行免疫组化，结果显示为A组对照组无胞浆内棕色着色表现，即无甲胎蛋白和白蛋白分泌，而B、C、D组都有AFP、ALB的表达，如图4、5。A组B组．J C组D组．J图4各个诱导组AFP免疫细胞化学染色(400x)A组B组．JD组图5各个诱导组ALB免疫细胞化学染色(400x)12 AFP在诱导7天后表达较多，分别计数每100个细胞中表达数为82．33_+2．52、79．33+2．08、87．33+_2．08，并且B、D组比较有差异(P0．05)。说明D组AFP在7天时表达率最高。在诱导15天时AFP表达减少，各诱导组(B、C、D)分别计数每100个细胞中表达数为17．33_+2．088、14．00_+2．65、22．33_+2．52，并且B、D组比较有差异(P0．05)，说明D组AFP在15天时表达率最高。在诱导20天后几乎没有表达，且B、C、D组两两比较无明显差别；ALB在7天、15天、20天都有强表达。诱导7天后，分别计数每100个细胞中表达数为95．33_+1．53、90．00+_1．73、86．67+1．53，并且B、C、D组两两比较比较都有差异(P<0．05)，说明B组ALB在7天时诱导率最高。在诱导15天后，各诱导组(B、C、D)比较B、c组比较有差异(P<0．05)，C、D组比较也有差异(P<0．05)，而B、D组比较没有差异(P>0．05)，说明B、D两组表达率高。在诱导20天后ALB各诱导组(B、C、D)比较B、C组比较有差异(P<0．05)，C、D组比较也有差异(P<0．05)，而B、D组比较没有差异(P>0．05)，说明B、D两组表达率高。每个诱导组设3张玻片，每张玻片计数100个细胞(10x40)，计数表达阳性细胞的细胞数。如表2所示：表2。各组在不同时间点AFP的表达 表3各组在不同时间点AFP的表达情况(X士s)注：诱导7天：+与}}比较P>0．05，+与△、+}与△比较P均<0．05。诱导15天：t与++比较P>0．05，+与6、}+与6比较P均0．05。表4各组在不同时间点ALB的表达情况表5各组在不同时间点ALB的表达情况(X=ks)注：诱导7天：}、+{与6两两比较P均<0．05。诱导15天：+与6比较P>0．05，+与++比较、料与6比较P均<0．05。诱导20天：+与△比较P>0．05，+与++比较、+t与6比较P均