五指山猪近交系eg细胞建系影响因素的研究

《五指山猪近交系eg细胞建系影响因素的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中文摘要本实验以五指山小型猪(WZSP)近交系为实验材料，先后由18头妊娠母猪采集了200枚早期胎儿，分别从不同饲养层、条件培养基、是否添加生长因子、传代过程中所用消化液等方面对其EG细胞的建系影响因素进行了研究；并对传代获得的EG细胞集落进行了鉴定。(1)从26～28d的新鲜猪胎儿可以获得大量的猪胎儿成纤维细胞(PEF)．经传代培养后即可纯化。实验过程中，PEF传至10代以上，可以在体外长期培养并可冷冻保存。本实验对F5代的PEF进行了核型分析，结果表明其在体外培养核型正常。(2)采集26．5d的WZSP胎儿53枚，其中33枚以经丝裂

2、霉素C处理的STO细胞作为饲养层；其余20枚采用未经丝裂霉素C处理的PEF与EG细胞共培养的方式进行培养。在使用同种培养基的条件下，比较不同饲养层对猪的EG细胞分离培养与传代的影响。结果表明，STO细胞适合用作猪EG细胞分离培养、传代的饲养层：而采用PEF与EG细胞共培养的方式只适于原代PGCs的分离培养，传代后，仍需以STO细胞制备饲养层才能维持EG细胞的未分化状态，PEF不能维持EG细胞的传代培养。(3)采集26．5d的WZSP胎儿35枚，其中的15枚用BRL条件培养基进行培养：其余20枚以高糖DMEM+15％FCS+2mmob'm

3、lL-谷氨酰胺+o．1mmol／ml非必需氨基酸+O．1mmo

4、／ml§．巯基乙醇+lOOIU／ml青霉素+100ug／ml链霉素常规培养基进行培养，研究BRL条件培养基对猪EG细胞培养与传代的影响。结果表明，以STO细胞作饲养层，使用BILL条件培养基与常规培养基在猪EG细胞分离培养、传代后均可获得细胞集落，而且使用BRL条件培养基培养产生的集落数多，细胞生长速度快。因此，BRL条件培养基适于猪EG细胞的培养传代。(4)采集26．5d的WZSP胎儿78枚。其中的43枚用常规培养基(培养基I)进行培养；剩余35枚在添加LIF、SCF、b

5、FGF三种生长因子的培养基(培养基II)中进行培养。研究不添加生长因子对猪的EG细胞分离培养与传代的影响。实验结果表明，以STO细胞作为饲养层，在两种培养基中都能得到可以传代的EG细胞集落。但在培养基I中原代EG集落出现时间晚，生长速度较慢，传代时间间隔长，EG细胞形态扁平：而在培养基II中原代EG集落很快出现，生长速度较快，传代间隔短。两种培养条件下获得的EG细胞都具有胚胎干细胞的形态和特征。结果提示，以STO细胞作为饲养层，不添加生长因子的培养基也可以维持EG细胞的培养、传代。(5)采集26．5d的WZSP胎儿34枚，分离胎儿PGC

6、s，以STO细胞为饲养层，以常规培养基进行培养。在EG细胞传代过程中，分别用dispase和o．25％的Trypsin．EDTA对其进行消化传代，比较两种消化液对传代的影响。结果表明，用两种消化液消化传代都能够获得新的可传代的EG细胞集落。因此，两种消化液均可用于EG细胞的传代培养。(6)对培养获得的3～4代的细胞集落进行鉴定，结果表明分离培养的EG细胞形态多样，集落内细胞排列紧密，集落边缘清晰．AKP染色呈强阳性，SSEA．1免疫荧光染色为阳性，Oct．4免疫荧光表达亦为阳性，体外悬浮培养可以形成简单类胚体，具有胚胎干细胞的诸多特征。

7、关键词：猪，原始生殖细胞，胚胎生殖细胞(EG细胞)IIIABSTRACTAtotalof200fetuseswerecollectedfrom18wuZhiShaninbreedingPigs(wzsP)tostudyt}1efhctorsinfluenceontheestablishmentofporcineembryonicgerm(EO)cellslines．Thefactorsincludedfeedercells，conditionmedium(CM)，growthfactorsanddigestingenzymes．More

8、over,EGcellsevaluationwascarriedout．(I)Porcineembryonicfibroblasts(PEF)wereobtainedfrom26～28dfetusesofWZSP,theycouldbepurifiedbypassaging．PEFwerepassagedtoFlo，itWaSshownthatPEFcouldbeculturedlong—terminvitroandpreservedat——196"C．ThenormalkaryotypeofPEFwasfoundoutatF5byka

9、ryotypeanalysis．f2、T0study也eeffectoffeedercellsonporcineEGcellsculturedinvitro，53fetuseswerecollectedfr