apodemus+sylvaticus胚胎干细胞的建系和生物学特性的研究

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1、李伟强硕士学位论文中文摘要Apodemussylvatitus胚胎干细胞的建系和生物学特性的研究专业：干细胞与组织工程硕士研究生：李伟强导师：李树浓教授蓝田教授摘要胚胎干细胞来源于胚胎时期囊胚的内细胞团，是一种多潜能的干细胞，能在体外进行长期的自我更新，在体内外可以分化为三个胚层来源的各种细胞类型，因而在基础研究和临床治疗中都有很好的应用前景。ApodemussylV8titus是一种啮齿类动物，与小鼠在进化方面两者差距比较大，与大鼠和小鼠之间的遗传差距相近。本研究建立了了Apoderoussy}VEtf』CUS的胚胎干细胞系，命名为As—Esl，具有

2、24xC染色体，能在体外长期培养传代中保持未分化状态，在体外自然分化能形成胚体，注射于裸鼠皮下能形成畸胎瘤。该细胞系表达多种多能性的分子标记，包括碱性磷酸酶、Oct一4、Nanog年URex一1，但是不表达SSeEt一1，ssea一3，SSea4，Tra一1—60和GCTM一2。本研究还成功将GFP和dsRED两种质粒转染该细胞系，同时细胞仍保持增殖和分化潜能，并用RNA干扰技术灭活上述两种基因在细胞内的表达，证明该细胞系能进行基因操作。AS—Es的建立为Apodemussy}V8ticus发育和遗传的研究提供重要的工具，使Apodemuss．r』Va

3、tl'CUS有望成为研究基因功能的新的模式动物。本实验包括两个部分：l、ApoderⅣusSr』VatJCOS胚胎干细胞系的建立李伟强硕士学位论文中文摘要2、Apodemussy]VEItY'CUS胚胎干细胞系的生物学特性分析第一部分Apodemussylyaticus胚胎干细胞系的建立材料和方法1．1动物饲养Apodemussy]VEttl"CUS的饲养条件于小鼠相似，包括饮食、温度等。1．2胚胎干细胞系的建立使用7—9N的ApodemussyJVaticus进行交配。取受精后3．5天母鼠的子宫，用M2培养液冲洗并收集囊胚，然后接种于预先接种好的放射

4、后的小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞的24孔板中。囊胚在培养卜2天后，胚胎会从透明带孵出，内细胞团明显增殖长大，继续培养3-4天，然后挑取增殖的内细胞团消化吹打成单个细胞，接种于新的饲养层细胞上。4—7天后即可以观察到未分化的胚胎干细胞克隆的生长。培养条件为37℃，5％C02和95％湿度。结果从受精3．5天的母鼠子宫中获得5个囊胚，其中的一个几天后长出大量的类似小鼠胚胎干细胞的克隆。这些克隆成圆形，边界清楚。克隆内的细胞排列紧密，核浆比例高，有明显的核仁，命名为AS—ESl。白血病抑制因子和饲养层细胞能够保持培养细胞的未分化状态，这与小鼠的胚胎干细胞类

5、似。结论成功从啮齿类动物Apodemussy]VatJcus的囊胚获得了一种新的胚胎干细胞系，它能在体外长期传代培养，细胞形态特征与小鼠胚胎干细胞类似。第二部分Apodemussylvaticus胚胎干细胞系的生物学特性分析材料和方法Il李伟强硕士学位论文中文摘要2．1生长曲线生长曲线是评估细胞生长特性的有效工具，从生长曲线可以确定群体倍增时间。以0．6×105／ml的密度接种于六孔板，每12小时消化细胞进行计数。以E14细胞株作为对照。2．2干细胞标记的表达为了检测该细胞的碱性磷酸酶活性，将细胞固定于4％的多聚甲醛／PBS，用碱性磷酸酶的底物BcIP

6、／NBT进行染色。为了进行免疫细胞化学的检测，用下列一抗进行孵育，包括SSEA～1，SSEA一3，SSEA一4，Tra一卜60，GCTM一2，orOCT4，然后用FITC标记二抗与一抗结合，最后用DARPI对样品进行染色，在荧光显微镜下观察。用RT—PCR检测各种基因得表达。首先从胚胎干细胞提取RNA，用SensisCl"ipt逆转录酶合成互补得CDNA，然后用PCR扩增目的基因。目的基因和其引物序列如下：Oet4，NanOg，Rexl，阳性对照用GAPDH。2．3核型分析和性别鉴定染色体的准备如下：在胚胎干细胞的培养液中加入0．1mg／ml的秋水仙素

7、温育一个小时，然后胰酶消化，用O．075MKcl溶液重悬室温下放置20分钟，再在甲醇／乙酸混合液(3：1)中固定一个小时，然后置于玻片上。分散的染色体用1％的姬姆萨染料染色然后拍片，至少要数20个出于分裂中期的分散染色体和分析5条G带的核型。该细胞株的性别通过PCR的方法鉴定，目的基因是基因组DNA的Y染色体相关基因Tspy，阳性对照用x染色体相关基因P01Al以及Gapdh。2．4体内外分化能力的检测体外分化：胚胎干细胞消化成单个细胞后接种于不贴壁的培养皿，使用不含白血病抑制因子的培养液，培养两周后可见大量胚体形成。然后将胚体接种于贴壁的组织培养皿进

8、行诱导分化。所得到的分化细胞用如下几种抗体进行检测：内胚层albumiiq，中胚层desmin