牛类滋养层干细胞建系的研究

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1、学校代码：10126分类号：论文题目学号：至】QQ昼Q】Q编号：——牛类滋养层干细胞建系的研究ESTABLISHMENToFBoVINETRoPHoBLASTSTEM．LIl

2、文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：艚教师签以翘，多彩日期：丛!呸之：丝日期：型!生叁如在学期间研究成果使用承诺书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有权将学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索，也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者在学期间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古大学就读期间导师的同意；若用于发表论文，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。学位论

3、文作者签日内蒙古大学博士毕业论文牛类滋养层干细胞建系的研究摘要在哺乳动物胚胎发育过程中，胚胎细胞第一次分化形成内细胞团和滋养外胚层。滋养层干细胞(trophoblaststemcells，TSC)是胎盘细胞的前体细胞，在胎盘发育中有重要作用。有蹄类滋养层干细胞的建系是公认的难点，目前仅在山羊、牛、猪等有蹄类动物获得滋养层细胞的报道，但这些研究并没有对这些细胞系多潜能性或干细胞的特征进行全面鉴定。因此这些细胞系可能处于有别于TSC的分化阶段。本研究比较了不同培养体系对牛类滋养层干细胞(bovinetrophoblaststem．1ike，bTS)建系的影响，特别对利用2i(PD03

4、25901和CHIR99021)获得的牛类滋养层干细胞bTS进行了鉴定，包括碱性磷酸酶检测、核型分析、干细胞多能性标志物基因表达情况和分化潜能的检测，以确定bTS是否为典型的牛类滋养层干细胞。我们采用寡聚核苷酸芯片检测了约23000个牛的转录物，还分别对干细胞多潜能性转录因子DCⅣ、NANOG、SOX2、CDX2基因的启动子区域甲基化情况进行了初步分析。主要研究成果如下：1不同的培养体系对牛类滋养层干细胞培养和建系的影响以DMEM／F12+NeurobasalMedium+N2827或单独使用DMEM／F12作为基础培养液，添加2i、FGF或Wnt3a，分别以LWnt．3A／ME

5、F混合细胞或BFF作为饲养层，探讨不同的培养体系对牛滋养层干细胞培养和建系的影响。结果表黄翔华牛类滋养层干细胞建系的研究明：2i培养液结合LWnt．3A／MEF和添加Wnt3a的2i培养液结合BFF两个培养体系中培养的bTS具有典型的类似小鼠TSC的形态，呈单层扁平生长，体外长期培养没有明显的形态变化，所建的细胞系最长己传至170代；而在去除小分子PD0325901并添加FGF的培养体系，无论使用LWnt．3A／MEF或BFF作为饲养层，细胞生长缓慢，虽然形态类似小鼠ESC，呈三维立体生长，但均未能传过18代。2bTS细胞系滋养层干细胞基本特性的鉴定本研究利用2i培养液结合LWn

6、t．3A／MEF所建立的细胞系BTS一1具有正常的二倍体核型。在体外长期培养中，该细胞系保持了未分化状态，碱性磷酸酶检测呈阳性，表达干细胞多能基因OCT4、NANOG、SOX2、TRA—J．60、TRA—J坩J『、SSEA—J和SSEA．4。同时表达TSC标志基因CDX2、TEAD4、EOMES、ELF5、GATA3、SMARCA4(BRGl)、ETS2和ERR2。bTS细胞体外可分化为类胚体或贴壁生长并形成双核滋养层细胞。分化的细胞中检测到滋养层分化标志物HANDl、MASH2和PL一，表达上调。在畸胎瘤实验中，bTS细胞能在NOD—SCID小鼠体内产生胎盘滋养层细胞。我们认为

7、bTS细胞具有滋养层干细胞的基本特征。此外，BTS一1细胞经GFP慢病毒转染并被DOX诱导后，14．81％的细胞能够表达GFP。3bTS细胞系的基因表达寡聚核苷酸芯片分析和甲基化分析在BTS一1中，有一些多潜能性基因表达水平低于其在囊胚中的表达水平，但高于它们在BFF中的表达水平，这一类基因包括OCT4、SOX2、GDF3、KLF4、KLF5、SFRP2、SMAD3、SPARC、STAT3、TBX3和THAPll；在BTS—l细胞和囊胚中，TDGF、MYCN、CCR4、血咒、SM