不同胚龄昆明小鼠胚胎获取胚胎干细胞体外培养的比较

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1、不同胚龄昆明小鼠胚胎获取胚胎干细胞体外培养的比较作者：秦书俭，张海锋，单伟【摘要】目的探讨分离培养昆明小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的最佳胚龄。方法分别从孕3.5d和4.5d的母鼠子宫中分离收集桑椹胚和囊胚，比较体外培养时胚胎的贴壁率、内细胞团(innercellmass,ICM)形成率、形成ES细胞克隆率(P1)和形成ES细胞亚克隆率(P2)。结果孕3.5d采集的胚胎多为桑椹胚，孕4.5d采集的胚胎多为囊胚，分离培养结果表明，后者的胚胎贴壁率、ICM形成率和ES细胞克隆形成率均高于前者，均有显著性差异(P<0.05)。结

2、论囊胚较桑葚胚更适合作为体外分离培养昆明小鼠ES细胞的材料。【关键词】昆明小鼠;胚胎干细胞;胚龄　胚胎干细胞(embryonicstemcells,ES细胞)是从早期胚胎内细胞团(innercellmass,ICM)或原始生殖细胞(primordialgermcells,PGCs)分离出来的能在体外长久培养的、具有多向分化潜能和种系嵌合能力的细胞系。ES细胞的用途很广，涉及医学和生物工程的许多领域。1981年，EVANS[1]和MARTIN[2]首次成功分离得到小鼠ES细胞。目前实验中常用的小鼠ES细胞系绝大多数来自129品

3、系，但129品系小鼠易感染多种疾病，具高频自发畸胎瘤，因此该品系小鼠不宜用于免疫学和细胞、组织移植等研究[3]。昆明小鼠是一种国产远交系小鼠，其基因型与人类近似，建立昆明小鼠的ES细胞系有利于其转基因动物的获得，能够更好服务于我国的科研工作。目前虽有关于昆明小鼠ES细胞的一些研究，但对于何时收集胚胎尚未有明确报道。本实验旨在研究胚龄对分离培养昆明小鼠ES细胞的影响。1材料与方法1.1实验动物选取8周龄昆明品系雄性小鼠21只;周龄为7～8周、体重为30g的雌性小鼠20只，用于分离培养鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryoni

4、cfibroblasts,MEF);周龄为4周、体重为24～26g的雌性小鼠55只，用于分离培养ES细胞。实验动物由辽宁医学院实验动物中心提供[动物质量合格证号：SYXK(辽)20030011]。1.2主要试剂与仪器LDMEM培养基(Gibco公司，批号1459071);HDMEM培养基(Sigma公司，批号055k8311);胎牛血清(中国医学科学院生物工程研究所，批号AB3101C091);丝裂霉素C(浙江海正，批号050912);白血病抑制因子(leukaemiainhibitoryfactor,LIF)(S

5、igma公司，批号064K1083);NBTBCIP染色试剂盒(华美公司，批号NBS206006);CO2培养箱(美国SIM公司，E191TC);倒置显微镜(日本Olympus公司，CKX41)。1.3实验方法1.3.1MEF的分离培养及饲养层的制备雌雄鼠合笼，每天早上观察阴道栓，见栓当天上午定为怀孕的第0.5天(dayspostcoitum,dpc);取孕12.5～14.5d母鼠，断颈处死，无菌条件下取出胎鼠，去除头部、尾部、内脏和四肢，用无菌眼科剪将躯干部剪成1mm3以下的碎块，用滤网过滤细胞法[4]分离培养MEF，并

6、制备MEF饲养单层。1.3.2胚胎的收集与培养分别取孕3.5、4.5d母鼠，断颈处死，无菌条件下取出子宫;用1mL无菌注射器吸入冲胚液，从子宫角端进针，保证针头进入子宫腔内，将冲胚液快速推入子宫腔;每侧子宫注入冲胚液0.2～0.5mL，冲胚液会将胚胎冲出;将盛有胚胎和冲胚液的平皿置于40～100倍的倒置显微镜下;用移液器(上海大龙公司，0.2～10μL，YR23777)收集胚胎;以文献[5]所示方法进行培养。1.4主要观察指标1.4.1生物学特性观察每日于显微镜下观察并记录胚胎的生长情况(包括形态、贴壁情况、ICM形成情况等

7、)。1.4.2碱性磷酸酶(AKP)检测胚胎经40g/L多聚甲醛固定0.5～2h;PBS洗涤3次;用TSMⅠ(0.1mol/LTris,0.1mol/LNaCl,0.01mol/LMgCl2,pH8.0)平衡，重复3次;再用TSMⅡ(0.1mol/LTris,0.1mol/LNaCl,0.05mol/LMgCl2,pH9.5)平衡，重复3次;加入NBT(350μg/mL)/BCIP(180μg/mL)，37℃避光反应30min;三蒸水洗涤3次，显微镜下观察。1.5统计学分析用SPSS11.5软件对实验所得数据采用t检验，P

8、<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1不同胚龄胚胎的生物学特征本实验共收集3.5dpc昆明小鼠胚胎91枚，4.5dpc昆明小鼠胚胎69枚，3.5dpc昆明小鼠胚胎多为桑椹胚(图1)，周围有透明带包绕;4.5dpc昆明小鼠胚胎多为囊胚(图2)，囊腔明显，滋养层被囊腔推到一侧，有些形